2015（更新）蛋白穿越重现之旅.pdf

蛋白穿越重现之旅
——Western Blot技术
北京全式金生物技术有限公司
Western Blot的起源和应用及原理
Western Blot实验流程详解
Western Blot实验中的常见问题分析
 Western Blot
蛋白质印迹法(免疫印迹试验)。它是分子生物
学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方
法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过
的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色
的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细
胞或组织中表达情况的信息。
Western Blot起源
 Renart, J., J. Reiser, G. R. Stark, (1979). "Transfer of proteins from gels to
diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for
studying antibody specificity and antigen structure." Proc Natl Acad Sci U S
A 76(7): 3116-20.
 DNA杂交技术,Southern Blot ---1975
 RNA杂交技术,Northern Blot ---1977
蛋白质印迹技术,Western Blot ---1979
Western Blot的应用
定性或半定量分析目的蛋白的特异性表达
蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后
续分析
蛋白修饰的鉴定(磷酸化、糖基化的鉴定)
Western Blot实验原理
直接法间接法
Western Blot实验流程
样品制备及定量 SDS-PAGE 转膜
显色发光抗体杂交封闭
样品制备
SDS-PAGE 转膜
及定量电泳
显色抗体杂交封闭
样品制备
总体原则
整个提取过程在低温下进行,保持蛋白处于溶解状态,
防止蛋白变性、降解与修饰。
根据实验目的选取不同抽提液和抽提方法。
有时需要去除体系中的核酸、无关蛋白等干扰成分
方法简便,耗时短,易于操作。
制备好的样品若不立即使用,需分装冻存于-80℃冰箱,
及防止储存过程中降解。