分析real-timePCR数据.doc

用2-△△Ct法分析real-time PCR数据
-----联合应用LightCycler Data Analysis软件和MS Excel
mee@
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1、打开存取的数据文件,点击
2、依次点击,,这是适合SYBR green为染料的选项。点击step1:Baseline下的“change graph settings”小图标。取消弹出的Customize Graph选项卡中的Logarithmis选项,点击“OK”按钮,退出选项卡。
3、点击下的“change graph settings”小图标
,取消弹出的Customize Graph选项卡中的Logarithmis选项,点击“OK”按钮,退出选项卡。
4、在选项卡中拖动红色标记线,选取个条曲线都为直线上升部位。
5、可以在选项卡中观察是否需选取的是曲线直线上升部分。观察绿线部分与S型曲线交叉的部分是否为直线。
6、如果确为直线,则左侧的“Crossing Point”值为所需要的Ct值。
7、依次选取下图菜单:将数据导出为文本文件。
8、打开所保存的文本文件,如图选取
9、将数据粘贴入新建的excel文件,“Crossing Point”列即是Ct值,删除“Standard”和“Calculated Concentration”列。
10、将目的基因,本例中为“iNOS”的Ct值按标本对应剪切入beta-actin值右侧一列。分别标记两列数据为“beta-actin”和“iNOS”。
11、设置所有Ct值的单元格格式
12、数字选项卡,分类选择为数值,点击确定。
13、将E列(目的基因Ct值右侧一列)输入公式“=D4-C4”,求出目的基因与同管beta-actin Ct值之差,即△Ct。
14、向下拉复制公式,将△Ct列数值计算出。
15、在△Ct 列右侧一列插入公式“=POWER(2,(0-E4))”,此即目的基因相对beta-actin的相对表达量,即2-△Ct(2的-△Ct次方)。
16、在2-△Ct列右侧插入公式“=F4/$F$4”,此列即“2-△△Ct”列,复制公式填满所有标本对应的2-△△Ct空格。
17、至此,2-△△Ct法计算的各标本目的基因的相对表达量完成,2-△△Ct列的数据可以用统计软件进行分析。