CYP2B6基因表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达.docx

CYP2B6基因表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达
【摘要】 目的:构建CYP2B6基因原核表达质粒,在大肠杆菌[Rosetta2(DE3)pLysS]中高效表达重组蛋白。方法:以质粒为模板,用PCR技术扩增出CYP2B6基因,并将其分别插入pET_22b(+)、pET_28b(+)和pET_32a(+)质粒中,经PCR、测序鉴定后,转化Rosetta2(DE3)pLysS,并用异丙基_β_D_硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果:经PCR、测序鉴定,构建了CYP2B6基因表达质粒;采用考马斯亮蓝染色法检测重组蛋白镒表达,pET_22b(+)_CYP2B6未见目的蝴蛋白表达;pET_28b艳(+)_CYP2B6有目ル的蛋白表达,约占蛋白总量谢的5%;而pET_32a洵(+)_CYP2B6可以恝高效地表达CYP2B6,掏在低浓度(50μmol/癍L)IPTG诱导3h后,所表达的CYP2B6蛋白约占细菌总蛋白的30%;噌质谱分析结果进一步证实所杵表达的蛋白为CYP2B6。结论:成功地使CYP2颓B6基因在原核系统中高效肯表达。
【关键词】 CY蛊P2B6大肠杆菌表达
[珞Abstract]Objective:Toconstructtheexp边ressionplasm祀idsofCYP2B6g踹ene,andtoexp蝇ressCYP2B6pr昆otEininEsche仟richiacoli[R裆osetta2(DE3)赀pLysS].Metho妇ds:TheCYP2B6柔genewasamplifiedbyPCRtec◇hniquefromth隶
etemplateoft蝰heplasmidcon横tainingCYP2B眍6gene,thenwasinsertedintoplasmidsofp聿ET_22b(+),pEッT_28b(+),and俦pET_32a(+)re髀spectively,andidentified文withPCRandsetta2(DE3)pLy玺sSandthetarg蘑etproteinexp蟀ressionwasinducedbyisopr馕opyl_β_D_thiogalactopyra秣noside(IPTG):binantp挪lasmidsofpET诱_22b(+)_CYP2B6,pET_28b(+骰)_CYP2B6,and氰pET_32a(+)_C︿massieBlruestainingme鼻thodwasusedt献odetecttheta彡rgetproteineepET_22b(+)_寻CYP2B6couldn鄞otexpresstar掼getprotein,t戥hepET_28b(+)o┻untingforabo豕ut5%oftotalp氐rotein;ThetaⅢrgetproteinw『asgreatlyexp呜ressedbypET_糇32a(+)_CYP2B谷6andtheexpre鲇ssionlevelofCYP2B6proteiれnwastob