HPLC法测定人尿样中内源性6β-羟基氢化可的松和氢化可的松色谱条件优化.doc

HPLC法测定人尿样中内源性6β-羟基氢化可的松和氢化可的松色谱条件优化
陈瑶万隽张晓光(厦门市妇幼保健院药学部 361003)
【中图分类号】【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2012)13-0290-03
【摘要】解析高效液相色谱法分离人尿样中内源性6β-羟基氢化可的松和氢化可的松4种不同色谱方案,研究改进思路,建立最佳分离色谱分离条件。
【关键词】6β-羟基氢化可的松氢化可的松高效液相色谱法尿液
药物代谢的主要场所是肝脏,肝脏进行生物转化则依赖于肝微粒体中的多种酶系,其中最重要的是细胞色素以P4503A(CYP3A),该酶系基因的多态性对药物代谢的影响已得到证实[1][2]。为了使患者获得最佳治疗效果,真正达到“用药个体化”的目的,需要侧定CYP3A的活性[3][4]。氢化可的松是内源性的糖皮质激素,体内经CYP3A4 代谢为6β-羟基氢化可的松,人尿中6β-羟基氢化可的松和氢化可的松比值可作为理想的体内非损伤CYP3A酶探针,用以评价其活性。采用高效液相法侧定尿液中尿样中内源性6β-羟基氢化可的松和氢化可的松的含量,是目前较常用的一种方法[5]。但尿液中含有多种内生物质,给6β-羟基氢化可的松和氢化可的松的分离带来一定困难。通过对尿样采取液夜萃取的方法提纯浓缩,减少杂质干扰;通过改变色谱条件,提高两种待测物质分离度。现将研究过程中所制定的各种色谱方案、改进思路做一简介。
1 材料及样品处理
材料 HP1100 系列高效液相色谱仪; Insertil ODS-3 250× 5um、Diamonsil C18(2) 250× 5um色谱柱;电子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO);高速离心机(湖南湘仪);漩涡混合器(海门麒麟);氢化可的松( 批号81K1132) 、6β-羟基氢化可的松( 批号
71K1296) 均为Sigma公司产品;甲醇、乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯。
【基金项目】厦门市科学技术局(3502Z20094018)资助
【作者简介】陈瑶(1967-),女,主任药师,教授。主要从事临床药学研究。Tel:0592-2662059
样品处理取冻存尿样于40℃温水浴中解冻,5mL尿样10000rmin-1离心10min,取3mL尿液加入试管中,加入3 mL醋酸乙酯提取液,漩涡提取3min。去水相,取有机相2 mL在45~50℃水浴中以氮气流浓缩蒸干。残渣用100μL甲醇溶解,振荡混匀,取20μL进样。
2 色谱方案解析
方案1

表1 梯度洗脱程序表
Tab 1 Program of flow-rate gradient elution
时间/min 流动相/%
Water(%) ACN(%)
0 78 22
8 78 22
9 60 40
30 60 40
流速:1ml/min 柱温:30℃
检测波长:UV 240nm 色谱柱:Insertil ODS-3 250× 5um

图1:尿样与标准品色谱图