(五)鉴定
基本手段:电泳分析,超离心法:单条带。
N端测定:n亚基蛋白有n个N端aa。
选用手段:沉降分析、溶解度分析、
结晶分析(能结晶的一般比较纯,具有活性)
还有恒溶度法分析
化学组成法测定最低分子量
SDS-PAGE法
凝胶过滤法
渗透压法
扩散系数法
沉降系数法和沉降平衡法
2 蛋白质的分子量大小测定
%的铁,
最小M= ×100= ×100 =16700
Fe分子量
Fe(%)
1)根据分子组成测定最低分子量
%的铁,
血红蛋白的实际分子量是 66800(= 16700 × 4)
2)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
带电物质在电场中迁移的速度受什么影响?
电荷多少
分子大小
形状
加入SDS和巯基乙醇?
SDS (十二烷基硫酸钠)
---sodium dodecyl sulfate
SDS 是一种阴离子去污剂,带有很多负电荷。与蛋白质结合以后,使蛋白质分子带有足够的负电荷,远远超过了蛋白质分子原有的电荷,蛋白质分子原有的电荷就变得无足轻重了。
SDS是一种变性剂,与蛋白质结合,改变了蛋白质单体分子的形状,均变成长椭圆棒状。所以在电场上移动的速度完全取决于蛋白质分子的大小。
注意:SDS-PAGE是将蛋白质解离成亚基,所以测出的分子量是亚基的分子量。
3)沉降分析法
沉降速度:指离心时,蛋白质分子在单位时间内下沉的距离。
沉降常数(沉降系数):当沉降界面以恒速移动时,单位离心场中的沉降速度。
S:沉降常数 v:沉降速度(cm/sec)
w:离心机转头的角速度(弧度/sec)
x:蛋白质界面中点离旋转中心的距离,
以cm计。
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