1 Ig提取.ppt

辛酸硫酸胺法提取血清中的IgG抗体
Purification of IgG from serum
by caprylic acid and ammonium sulfate
原理
本实验将采用辛酸沉淀非免疫球蛋白和硫酸胺沉淀免疫球蛋白两个步骤,从血清中纯化多克隆IgG抗体。
辛酸为短链脂肪酸,在酸性条件下可沉淀腹水或血清中的非Ig蛋白;当加入33%-45%饱和硫酸胺时,IgG可被沉淀。
方法
血清的处理取-20℃冻存的血清,经定性滤纸滤过于三角瓶,加入4倍体积的pH 、60 mmol/L醋酸缓冲液, N NaOH或10%。
辛酸沉淀非Ig蛋白室温下每毫升样品稀释液加入辛酸70ul,缓慢滴加,边加边搅拌,持续30分钟后,1900 rpm离心30 min,去除上层悬浮物及沉淀,收集上清。
(1)经辛酸沉淀后收获的上清用定性滤纸过滤于量筒中,、 mol/L PBS。
(2)用 3 N 。
(3)将液体移至三角烧瓶,磁力搅拌下, (45%饱和度),边加边搅拌,继续搅拌30 min。
(4)以1900 rpm 离心30 min,弃上清,收集沉淀物,、 mol/L PBS(约2ml)中。
3. 硫酸胺沉淀Ig
将溶解液装入透析袋,自来水流水透析60min,、 mol/L PBS中搅拌透析至透析液中无NH4+离子存在(透析24hr,其间换液4次)。
将所得液体加温处理56℃、30min,然后经1900 rpm离心30 min,上清即为纯化的抗体液。
4. 透析除去硫酸胺
5. 含量测定
所得IgG蛋白作适当稀释后(1:20)(、 mol/L PBS)用紫外分光光度计测OD280值。
根据下列公式计算含量:
IgG蛋白含量(mg/ml)=(OD280/)× 稀释倍数。
收获总量(mg)=mg/ml × 收获抗体液体积
计算每毫升血清得IgG 多少mg。
 双向琼脂扩散试验
可用已知抗原(或抗体)检测未知抗体(或抗原)
检测抗原或抗体的纯度,分析和鉴定抗原与抗体的成份
半定量滴定抗血清的效价。
用途
双向琼脂扩散试验
%生理盐水琼脂
浇板(4ml/玻片)
冷后打孔
加样(12ul/well)
湿盒,37℃反应24 hr
抗人血清
盐水
1:32
1:2
1:4
1:8
1:16
观察孔间沉淀线的数目与特征:
如为单一沉淀线则纯度高
有沉淀线则有活性
样品稀释
加样枪、EP管
1:2
1:4
1:8
1:16
50ul
50ul 样品
50ul
50ul 样品
50ul
50ul 样品
50ul
50ul 样品