新兽药特殊毒性试验技术要求.doc

新兽药特殊毒性试验技术要求
  限于国内现有条件,经研究确定新兽药特殊毒性试验(“三致试验”)一般只进行致突变试验和致畸试验。在致突发试验中,考虑到检测终点应有原核细胞和真核细胞,基因突变和染色体畸变,体内和体外试验系统,体细胞和生殖细胞之分,确定Ames试验和微核试验为必做试验。精子畸形、睾丸精原细胞染色体畸变、显性致死三者可以任选一项,若前二者任一项为阳性均必做显性致死试验。这样,在致突变试验中必须至少做三项试验。在致畸试验中,对一般兽药来说,传统致畸试验为必做试验;对饲料药物添加剂还应增加养致畸试验,喂养繁殖毒性试验。喂养繁殖毒性试验一般只做一代繁殖毒性,一代为阳性时应再做第二代繁殖毒性,即:
各项试验方法如后:
一、艾母氏(Ames)试验方法
1、菌种
组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102四个标准株。
2、菌种鉴定
以上菌种需分别作抗氨苄、抗四环素、抗紫外、结晶紫、组氨酸需求、自发回变数的鉴定。
3、剂量分组
每次试验要求4~5个剂量组,每个剂量做三个平行平皿。高剂量以不抑菌为原则。~50μl/皿之间选择,~,。选定后的剂量应配制成适当浓度,使每皿加入受检物的体积为100μl或200μl。
4、溶剂
一般以水为溶剂,选用其他溶剂需说明理由。
5、对照物
每次检测要求同时作阳性和阴性对照;用已知的阳性物作阳性对照,用溶剂作阴性对照。加S9混合液时要同时作不加S9混合液的对照平皿。
6、S9制备
选体重200克左右成年雄性大鼠,经诱导剂诱导后宰杀,处死前12小时禁食。在低温条件下,无菌操作取出肝脏,用KCI液淋洗后置匀浆器中制成匀浆。低温离心后分装,保存于液氮或-80℃冰箱中。制得的S9需作S9活力测定。
7、试验步骤
将经鉴定合格的TA97a、TA98、TA100和TA102菌株分别接种于增菌培养液中。37℃水浴振荡培养,每毫升活菌数不得少于1~2×109。
受检物,包括对照物,按设计剂量配制。~,,,依次加入无菌小试管中,37℃水浴振荡培养20分钟后(也可采用平板掺入法),加入45℃,混匀倒入含底层培养基的平皿上,37℃培养48小时。
8、结果评价
在计数菌落前应先观察背景菌苔的生长情况,正常的背景菌苔应呈均匀的砂粒状。受试组与阴性对照组的背景菌苔应一致,阴性对照组的自发回数应在正常值之内。
受试组的菌落数大于2倍自发回变数,并有剂量反应关系和重现性,判为诱变阳性。
二、微核试验
1、动物
选择成年健康小鼠(应注明品系),将小鼠随机分为受试组和对照组。每组动物数不少于10只(雌、雄各半)或至少6只雄性动物。
2、受试物的处理
将受试物溶于适宜的溶剂中,~。
3、给药方式
原则上采用与推荐临床使用相同的给药途径,内服时应用灌胃法。给药剂量以LD50为依据,设3个剂量组。高剂量组应出现毒性反应,~;~。
每次试验应同时设阴性对照组和阳性对照组,阳性对照物可选用已知的能诱发微核阳性的诱变剂。
4、试验操作
一次给药一般在24,48,72小时取样制片。或二次给药,从第二次给药后的6,24小时取样制片。处死小鼠取骨髓,将骨髓洗入离心管中,离心。常规涂片。姬姆萨染色,镜检。
5、镜检
采用双盲法计数分析,每只小鼠在同一张片子上计数1000个嗜多染红细胞,同时计数嗜多染红细胞(PCE)同正染红细胞(NCE)之比。必要时,亦可采用吖啶橙染色,荧光显微镜分析计数。
6、结果评价
将数据列表,分别列出嗜多染红细胞数,微核数及PCE/NCE之比。所得结果用t检验进行数据分析,经重复试验P<,判为阳性。
三、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验
1、细胞
采用中国仓鼠卵巢细胞系CHO,染色体数目21。或中国仓鼠肺细胞系CHL,染色体数目25。
2、细胞培养
使用MEN-Eagle’s培养基或1640培养基,配制完全培养液,加15%灭活的小牛血清,100IU/ml青霉素,~。进行常规单层细胞培养。在细胞处于指数生长期时用胰酶-EDTA液处理,并自培养瓶表面将细胞洗脱下来。计数每毫升培养液含有的细胞数。在含有10ml培养液的25cm2的培养瓶中加2~5×105个细胞。在37℃,湿度95%,5%CO2培养箱中培养过夜。
3、试验分组与剂量
试验分3个受试组,另