碱裂解法提取质粒.ppt

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演讲人姓名
一、实验目的
通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理及操作。
二、实验原理
质粒(Plasmid) ：
质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。 在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。
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质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，具有以下特点：
易于鉴定；
易于导入受体细胞。
在受体细胞中可以独立复制；
易于筛选；
二、实验原理
高碱
细菌的细胞壁破裂，内容物释放
①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA；
②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。
①质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状；
②双链DNA并不完全分离。
高酸中和至中性
变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物
质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中
纯化
RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质
SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性(NaOH)环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。
三、主要试剂及作用
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溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成 (保护、缓冲)
葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的 机械剪切作用,防止破坏质粒 (保护作用)
EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对质粒分子的降解作用（保护作用）
Tris-HCl 使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）
溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与 NaOH 组成(裂解、变性)
SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）
NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）
溶液III：HAc和 KAc组成的高盐溶液 (复性，分离)
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HAc溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。
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KAc会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。
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