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3D-DPSCs/EPCs共培养物成牙本质分化及促血管生成的实验研究
摘要：
近年来，越来越多的研究表明，人体获取自体干细胞已成为一个重要的治疗前景。牙髓腔干细胞（DPSCs）流行于牙科领域，并被作为一种很有潜力的治疗用途的干细胞。血管内皮细胞（EPCs）成为新的热点，因为它们在血管发生和修复中具有重要作用。本研究旨在探索DPSCs和EPCs能够共同作用于3D共培养体外条件下的牙本质分化和促进血管生成的影响。
通过将DPSCs和EPCs分别分离培养，我们证实了两种细胞的存在。对于每组试验，DPSCs和EPCs的细胞生长状态均处于类似状态。结果表明，每组材料的3D共培养可以促进DPSCs和EPCs的相互作用，有效地激活BMP-4和VEGF基因表达水平在分化的过程中发挥作用，。酸性磷酸酶和von Kossa染色方法进一步证实了DPSCs/EPCs共同处理后牙本质分化，形成源自牙髓和牙龈的新牙本质和血管。CD31染色进一步证明了新生血管在3D-DPSCs/EPCs共同处理后形成。
结论：
本研究进行的3D-DPSCs/EPCs共培养体外实验表明DPSCs和EPCs的共同作用促进了牙本质的形成和血管的发育。这些发现表明，DPSCs和EPCs的共同应用可能成为促进牙科再生研究和治疗方面的重要战略。
关键词：牙髓腔干细胞（DPSCs）；血管内皮细胞（EPCs）；3D共培养；牙本质形成；血管发育
Introduction
牙髓腔干细胞（DPSCs）被广泛研究，应用于牙科领域。DPSCs具有自我更新、多能性分化、克隆扩增和修复功能，显示出优异的牙齿再生潜力。血管内皮细胞（EPCs）被广泛地研究，因为它们在血管发生和修复中发挥着重要的作用。EPCs可以释放出许多生长因子，如造血干细胞因子、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子和转化生长因子-β，从而对于血管的形成和分化都具有极大的作用。
更多的研究显示，DPSCs和EPCs的共同应用可以通过增加新的细胞-细胞相互作用和细胞-外基质连接来促进牙齿再生潜力。通过共同增强DPSCs/EPCs之间的相互关系，可以更有效地促进牙齿发展和治疗进程中的血管生成。
材料和方法
DPSCs和EPCs的提取
用12 ml离心管收集5个人的下颌第三磨牙，然后用高氯酸液枯燥处理后收集牙本质和内髓组织，％胎牛血清（FBS）的基础培养液中，通过重复的捏击将DPSCs和EPCs分离。DPSCs和EPCs的细胞形态学和细胞生长（MTT）基础实验表明，确保两种细胞的存在。
3D细胞培养
将明胶溶于PBS中，均匀涂敷在96孔板中。DPSCs和EPCs被分别种植在明胶上，并分为4组处理：单独的DPSCs; 单独的EPCs; DPSCs和EPCs的混合，以50％V/ V比例; 3D-DPSCs和EPCs的共同处理培养。首次处理1天后，将培养基改为DF-12/F12 (1:1) 并与10％FBS添加到DPSCs / EPCs 3D共同处理组中。在不同的时间点上用 qRT-PCR 来检测 BMP-4 和 VEGF 的基因表达水平。
分化分析
4周后通过酸性磷酸酶染色和von Kossa染色以评估牙本质分化情况，用CD31免疫荧光染色来证明新生血管的形成情况。
结果
细胞培养
图1. DPSC 和 EPC 共同培养 生成的 3D 生物印迹。DPSCs和EPCs 构成的 3D 生物印迹形成了一个牙形状，表明两种细胞可以在共同处理下存在于同一培养板上。
基因表达
通过 qRT-PCR 测量，BMP-4 和 VEGF 的基因表达水平在 3D-DPSCs/EPCs 共同处理时显著增加。如图所示，DPSCs/EPCs干细胞混合处理组在4周的培养期内得到了类似的增加。
图2. BMP-4和VEGF基因表达量。DPSCs / EPCs 3D 共同处理组在 BMP-4 和 VEGF 的基因表达方面表现出较高的表达量。
牙本质分化情况
酸性磷酸酶和von Kossa染色显示，只有经过 DPSCs/EPCs 共同处理的细胞培养才会导致能够分化为新的牙质组织。如图所示，只有 DPSCs 和 EPCs 在干细胞混合处理后产生的 3D 映像中形成了一个类似于牙齿的形态。
图3. von Kossa染色结果。左边一列是DPSC处理组和EPC处理组的结果，右边一列是DPSC / EPC 3D 共同处理组的结果。其中只有 DPSCs 和 EPCs 共同处理后具有形成牙齿的能力。
血管生成
CD31 染色使用作为血管内皮细胞标记，进一步证明了新生血管的形成情况。如图所示，只有经过共同处理的 DPSCs 和 EPCs能够产生新的血管生成。
图4. CD31染色结果显示只有经过 DPSCs / EPCs 共同处理的细胞培养才能产生新的血管形成。
讨论和结论
DPSCs和EPCs的3D共同处理能够促进牙本质与血管的形成。我们的研究证实了3D-DPSCs/EPCs共同处理通过BMP-4和VEGF基因的相互激活作用，促进了牙体内细胞的分化和血管形成。酸性磷酸酶和von Kossa染色进一步证明DPSCs/EPCs共同处理下新的牙体形态。CD31染色显示了新的血管形成，这表明DPSCs和EPCs的共同应用可以成为促进牙本质形成和血管发育的有效方法。
总之，DPSCs和EPCs的3D共同处理体外实验结果表明，这种方法对于实现牙本质发展和治疗方面的改进具有潜在的重要作用。未来的研究应注重每个因素对于分化产物产生的影响，并进一步说明DPSCs/EPCs的相互作用机制，在此基础上进行临床前研究和临床试验，推动该种方法的进一步应用。