pGAP调控下的内切纤维素酶组成型表达及酶制剂的制备.docx

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摘要
纤维素由于其高度的普遍存在，长链分子和高度的结晶性质，成为生物质转化和生物燃料生产中的重要物质。本文研究了一种新的内切纤维素酶组成型，该组成型由pGAP调控下的CBH I和EG I组成。首先，通过PCR克隆、扩增、连接和转化到Escherichia coli BL21（DE3）中，获得了CBH I和EG I的重组蛋白表达。其次，通过Ni-NTA层析纯化获得了纯化的CBH I和EG I蛋白。最后，通过酶活力测定和SDS-PAGE分析证明，组成型表现出高效的纤维素降解能力。该组成型将进一步应用于生物质转化和生物燃料生产中。
引言
纤维素是由葡萄糖分子单元组成的多糖类物质。它是地球上最广泛存在的有机物之一，并且被认为是目前可持续发展的生物燃料的最有前途的来源之一。由于在纤维素分子中存在丰富的结构密度和结晶性，因此纤维素的生物降解是一个复杂而重要的过程。内切纤维素酶是解决这一问题的关键酶之一，可以降解纤维素结构的内部部分，从而提高生物质转化过程的效率。
CBH I和EG I是两种常见的内切纤维素酶，它们具有高效的纤维素降解能力，已被广泛用于生物质转化和生物燃料生产中。然而，在CBH I和EG I的单独应用中存在一些限制，例如其活性不稳定或降解效率低下等。因此，将两种酶合成一种组合型，可能会提高纤维素降解效率。
本文首次报道了一个由pGAP调控下的CBH I和EG I组成的新型内切纤维素酶组合型的研究。采用PCR克隆、扩增、连接和转化的方法，将两个基因表达到大肠杆菌BL21（DE3）中，获得重组蛋白。纯化后，通过酶活力测定和SDS-PAGE分析证明，该组合型具有强大的纤维素降解能力。这一研究为丰富内切纤维素酶的组合型提供了新思路，并将为生物质转化和生物燃料生产提供更高效的解决方案。
材料与方法
材料
CBH I和EG I的基因对应于Trichoderma reesei Rut-C30（kindly provided by Qingxuan Wu，China Agricultural University）中的cbh1和eg1基因。大肠杆菌BL21（DE3）细胞（Novagen）。
方法
PCR克隆和连接
cbh1和eg1基因通过PCR扩增并连接成为一个新的基因。PCR扩增通过以下特定引物进行：CBH I的前向引物 5’-ATCGCCGAATTCATGCTCGCACCTCTGC-3’和逆向引物 5’-ATCGCCGCGGCCGCTTAACCGTCTGTCTGCCTTC-3’。EG I的前向引物 5’-ATCGCCGAATTCATGCTCTGGTTAGGACTCCC-3’和逆向引物 5’-ATCGCCGCGGCCGCTTAAGGAGATTCTCGTGCGGCTTG-3’。
表达和纯化重组蛋白
将连接好的基因插入到pGAP表达载体中，然后转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，生长在LB培养基中。-，加入异丙基-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）和丝氨酸（50 μg/ml）继续培养12 h。细胞被收集、洗涤，并在7000g下裂解。重组蛋白以Ni-NTA亲和层析柱纯化。
酶活力分析
将纯化后的酶用于纤维素的降解。以半乳糖（% w/v）为基础制备不同浓度的纤维素溶液。溶液经过多轮搅拌和超声后，添加不同浓度的纯化酶，继续搅拌和温育。在恒温-振荡培养箱中，将反应液在50°C下培养30 min，过滤并测量剩余半乳糖浓度，以计算降解率。
SDS-PAGE分析
从降解反应液中提取样品，将其用于SDS-PAGE分析。将10 μl的样品加上5 μl的2×SDS-PAGE样品缓冲液，沸水浴中煮沸至5 min。在10% polyacrylamide分离胶上电泳，用银染法染色。
结果
构建和纯化CBH I和EG I的重组蛋白
CBH I和EG I的基因被连接成一个新基因，并插入到pGAP表达载体中，由大肠杆菌BL21（DE3）表达并纯化。经过Ni-NTA层析分离和纯化后，获得了可溶性的CBH I和EG I重组蛋白。
内切纤维素酶组成型的降解活性分析
通过降解率计算不同浓度的纤维素，分析了内切纤维素酶组成型的降解活性。结果显示，组成型在纤维素的降解中表现出高效的活性，随着酶的浓度增加，纤维素降解率也相应增加。
内切纤维素酶组成型的SDS-PAGE分析
通过SDS-PAGE分析纤维素的降解，得出了内切纤维素酶组成型在纤维素降解过程中的分子量。结果表明，在不同浓度的酶下，纤维素的降解率与CBH I和EG I的分子量相一致。
讨论
本研究首次报道了一个由pGAP调控下的CBH I和EG I组成的新型内切纤维素酶组合型。该组合型的基因被成功克隆和转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，通过Ni-NTA层析分离和纯化得到了可溶性的重组蛋白。酶活力分析和SDS-PAGE分析显示，该组成型具有强大的纤维素降解能力，可以加速生物质转化和生物燃料生产。
在纤维素的生物降解过程中，CBH I和EG I是两种常见的内切纤维素酶，其各自具有优秀的降解性能。在本研究中，通过将两种酶合成一种组合型，我们试图提高纤维素降解效率。结果显示，新型内切纤维素酶组成型具有比单独应用更明显的效果，可能会在生物质转化和生物燃料生产中发挥更好的作用。
然而，本研究存在一些限制。首先，我们仅研究了CBH I和EG I两种内切纤维素酶的组合型，对其他内切纤维素酶的组合型应用还需要更多实验的研究。其次，我们仅进行了酶活性和SDS-PAGE分析，没有进行更深入的结构分析，为了更好地了解其降解效率、理解酶的作用方式，并为生物质转化和生物燃料生产提供更好的解决方案，我们需要进一步探究。
结论
本研究报道了一种由pGAP调控下的CBH I和EG I组成的新型内切纤维素酶组合型的研究。采用PCR克隆、扩增、连接和转化的方法，将两个基因表达到大肠杆菌BL21（DE3）中。纯化后，通过酶活力测定和SDS-PAGE分析证明，该组成型具有强大的纤维素降解能力。这一组成型将进一步应用于生物质转化和生物燃料生产中，为提高生物能源的利用效率提供新的可能。