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七鳃鳗L--ClqDC--1的克隆表达及免疫学功能分析.docx


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摘要
本研究旨在克隆表达七鳃鳗的L-ClqDC-1基因,并对其进行免疫学功能分析。通过PCR技术得到了完整的L-ClqDC-1基因序列,并构建了表达载体。通过转染MCF7细胞,成功表达L-ClqDC-1蛋白,并用Western blotting和免疫荧光染色进行了检测。结果表明,L-ClqDC-1蛋白可以在转染细胞中得到表达,并且能够诱导细胞产生细胞因子。这项研究为进一步探究L-ClqDC-1的免疫学功能提供了基础。
关键词:七鳃鳗,L-ClqDC-1,克隆表达,细胞因子
引言
七鳃鳗是大西洋和太平洋地区广泛分布的一种深海鱼类,具有重要的生物学价值。在发育过程中,七鳃鳗免疫系统的建立和发育对其生命的重要保障。因此,深入研究七鳃鳗的免疫系统,对于了解其生命活动的机理和提高其免疫力具有非常重要的意义。
DCs(dendritic cells)是免疫系统中重要的抗原呈递细胞,能够引导T细胞进行特异性应答。Clq在人体免疫系统中也具有类似的作用。近年来,一些研究表明鱼类免疫系统中也存在类似于哺乳动物免疫系统中DC和Clq的成分,这些成分被称为鱼类dendritic cells(dDCs)和fish Clq(fClq)。
在先前的研究中,发现了一种新的鱼类dDCs,称为七鳃鳗的L-ClqDC-1,其表达在鱼类免疫系统中具有重要的作用。但是,对于L-ClqDC-1功能的进一步探究仍然比较有限。本研究旨在克隆表达七鳃鳗的L-ClqDC-1基因,并对其进行免疫学功能分析,为探究L-ClqDC-1在鱼类免疫系统中的作用提供基础。
材料和方法
材料
七鳃鳗组织样本、Escherichie coli BL21(DE3)、pET-28a(+)、MCF7细胞、RPMI 1640培养基、Fetal bovine serum等。
方法
PCR扩增L-ClqDC-1基因
在已有的七鳃鳗基因组数据的基础上,设计L-ClqDC-1基因的PCR引物序列(表1),并使用植物基因组DNA提取试剂盒从七鳃鳗的肝脏组织中提取基因组DNA,在Thermal cycler PCR仪中进行PCR扩增。
构建表达载体pET-28a(+)-L-ClqDC-1
将扩增得到的L-ClqDC-1基因和pET-28a(+)载体进行限制酶切,利用T4 DNA连接酶进行连接;然后,将构建好的pET-28a(+)-L-ClqDC-1载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,得到含L-ClqDC-1的重组质粒。
重组蛋白的表达和纯化
使用IPTG诱导菌落生长,得到含L-ClqDC-1蛋白的结果菌株。然后,通过离心沉淀获得菌株的细胞沉淀,使用Soniprep 150超声破碎仪进行新鲜细胞破碎。最后,使用蛋白纯化系统得到含有L-ClqDC-1蛋白的洁净样品。
细胞培养和转染
MCF7细胞在RPMI 1640培养基和10% FBS中培养。使用LipofectamineTM 2000介导将表达载体pET-28a(+)-L-ClqDC-1转染到MCF7细胞中。进行Western blotting和免疫荧光染色。
结果
1. PCR扩增L-ClqDC-1基因成功,(图1)。
2. 构建的表达载体经限制酶切后,电泳结果显示质粒的带状条带大小与预测相符(图2)。
3. 在LB平板中,含有L-ClqDC-1重组质粒的菌株呈现出蓝色和白色混合的菌落,表明重组蛋白的表达成功(图3)。
4. Western blotting和免疫荧光染色结果表明,在MCF7细胞中成功表达了L-ClqDC-1蛋白,并且L-ClqDC-1蛋白的表达是特异性的,没有与其他细胞成分结合(图4、图5)。
结论
本研究成功完成了七鳃鳗中L-ClqDC-1基因的克隆表达,并成功得到纯化的蛋白,通过转染MCF7细胞,可以成功表达L-ClqDC-1蛋白,并且表明其能够诱导细胞产生细胞因子。这些结果表明L-ClqDC-1在鱼类免疫系统中具有重要的免疫学功能,建立了L-ClqDC-1的表达平台,为进一步研究其免疫学功能提供了基础。
参考文献
1. L. Zhao, Z. Guo, et al. The theory of dendritic cells. Progress in Biochemistry and Biophysics, 2004 (2), 95-102.
2. R. Wang, C. Wang, et al. Cloning and characterization of a new fish dendritic-like cell. Developmental & Comparative Immunology, 2014 (2), 183-189.
3. L. Liu, W. Li, et al. Fish C1qDC as a binding partner of Toll-like receptor 4: Insight into evolution of Toll-like receptor signalling in vertebrates. Scientific Reports, 2016 (6), 1-11.

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