复合益生菌液态发酵黄芪的制备方法.docx

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郭雄伟;王石磊;史洪涛;乔宏兴;宋予震;汤法银;边传周
【摘 要】为争论复合益生菌液态发酵黄芪的制备方法,提高发酵液在临床应用中的作用效果,利用排列组合的方法,将枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌按挨次接种至同一培育基,培育肯定时间后观看各菌种的生长状况,确定菌种接种挨次;然后再用单因子试验法,以发酵液中菌体数量为指标,确定枯草芽孢杆菌的发酵时间,乳酸菌和酵母菌的接种时间、接种量以及发酵时间;最终,按优化的培育条件进展中试扩大试验, 显示,利用多菌种对黄芪提取液进展混合发酵的制备方法能够实现,接种挨次为枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌;最优发酵条件为: 枯草芽孢杆菌以 ％的接种量,于 37℃培育 24 h 后,以 ％的接种量接入酵母菌, 于 28 ℃培育 48 h 后,再以 ％的接种量接入乳酸菌,于 37℃静置培育 24 h;中试扩大试验所得发酵液中,枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌含量分别为 ×108、×108、 × 108 cfu/mL,终末 pH 值为 ,利用复合益生菌液态发酵黄芪的制备方法具有较好的可行性.
【期刊名称】《河南农业科学》
【年(卷),期】2025(048)001
【总页数】6 页(P128-133)
【关键词】枯草芽孢杆菌;乳酸菌;酵母菌;混合发酵;黄芪
【作 者】郭雄伟;王石磊;史洪涛;乔宏兴;宋予震;汤法银;边传周
【作者单位】河南牧业经济学院,河南郑州 450046;郑州市益生菌发酵中药重点试验室,河南郑州 450046;河南省益生菌生物转化工程技术争论中心,河南郑州
450046;河南省微生物生物转化中药工程试验室,河南郑州 450046;郑州市质量技
术监视检验测试中心,河南郑州 450007;河南牧业经济学院,河南郑州 450046;郑州市益生菌发酵中药重点试验室,河南郑州 450046;河南省益生菌生物转化工程技术争论中心,河南郑州 450046;河南省微生物生物转化中药工程试验室,河南郑州450046;河南牧业经济学院,河南郑州 450046;郑州市益生菌发酵中药重点试验室, 河南郑州 450046;河南省益生菌生物转化工程技术争论中心,河南郑州 450046;河南省微生物生物转化中药工程试验室,河南郑州 450046;河南牧业经济学院,河南郑州 450046;郑州市益生菌发酵中药重点试验室,河南郑州 450046;河南省益生菌生物转化工程技术争论中心,河南郑州 450046;河南省微生物生物转化中药工程试验室,河南郑州 450046;河南牧业经济学院,河南郑州 450046;郑州市益生菌发酵中药重点试验室,河南郑州 450046;河南省益生菌生物转化工程技术争论中心,河南郑州450046;河南省微生物生物转化中药工程试验室,河南郑州 450046;河南牧业经济学院,河南郑州 450046;郑州市益生菌发酵中药重点试验室,河南郑州 450046;河南省益生菌生物转化工程技术争论中心,河南郑州 450046;河南省微生物生物转化中药工程试验室,河南郑州 450046
【正文语种】中 文
【中图分类】
中草药是目前公认的绿色饲料添加剂，其在增加动物机体免疫力、抗菌、抗病毒等方面具有良好的作用效果[1-2]。但是中草药在临床应用中也存在肯定缺点，如添加量较大、适口性较差、本钱较高等，对其在动物生产上的推广与应用产生了不利的影响。常作为饲料添加剂的益生菌如枯草芽孢杆菌、乳酸菌等，具有增加动物机体免疫力、调整肠道菌群平衡、维持肠黏膜完整性及提高肠道消化吸取功能的作用
[3-4]。结合现代微生物发酵工程技术，利用益生菌对中草药进展生物转化是对中
草药炮制方法的创，该技术能提高中草药的临床应用效果，主要表现在削减用药剂量、提高有效成分作用速率以及具有多功能性等，并且能降低某些药物的毒副作用[5]。一方面，中草药黄芪在提高动物机体免疫力、抗应激和抗氧化力量方面具有良好的作用效果，并且对枯草芽孢杆菌和乳酸菌等益生菌的体外增殖具有良好的促进作用；另一方面，黄芪经益生菌发酵后临床效果得到加强，用量减小的同时， 提高了临床应用价值[6-7]。目前，关于发酵黄芪制剂的开发争论，主要集中于利用 1 种或 1 类益生菌对黄芪进展生物转化，多菌种混合发酵争论较少。本争论利用枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌对黄芪进展分段复合发酵，旨在增加益生菌对黄芪生物转化的效果，发挥多菌种协同作用，加强复合益生菌黄芪发酵制剂的多功能特性，提高其临床应用效果。
材料和方法
试验材料及主要仪器
试验用黄芪饮片购于亳州药材市场；枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌菌种由河南牧业经济学院发酵中药试验室保存；养分琼脂培育基、莫匹罗星锂盐 MRS 培育基均购于北京澳博星生物技术；马铃薯液体、琼脂培育基(含氯霉素)均购于青岛高科技工业园海博生物技术；恒温培育箱购于宁波莱福科技； 恒温摇床购于天津路业试验仪器公司；电子天平购于郑州通渠商贸；200 L 全自动发酵罐购于镇江东方生物工程设备技术公司。
菌种活化
将枯草芽孢杆菌、酵母菌及乳酸菌菌种的甘油冻存管置于室温，溶化后用无菌接种环挑取少量菌种分别划线接种于养分琼脂培育基、马铃薯琼脂(含氯霉素)培育基和莫匹罗星锂盐 MRS 琼脂培育基，分别在 37、28、37 ℃倒置培育 24 h，然后将其转接至相应液体培育基，适宜条件下培育 24 h 后备用。
黄芪提取液的制备
准确称取适量的黄芪饮片，分别加 5、4、4 倍量的水，煮沸 3 次，每次约 40 min ， 分别留取每次滤液，最终合并 3 次滤液并浓缩至黄芪质量浓度为 g/mL，保存
备用。
黄芪添加量、发酵培育基及发酵条件
黄芪提取液的添加量为：每毫升培育基中含黄芪 g。发酵培育基组成为：每
100 mL 培育基中含黄芪 g、豆粕 g、玉米 g、麸皮 g；培育基初始 pH 值均为 ，装液量均为 100 mL(500 mL 三角瓶)[8]。枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌发酵温度分别为 37、28、37 ℃，乳酸菌静置培育，枯草芽孢杆菌和酵母菌置恒温摇床转速 160 r/min 培育。
复合菌种分段发酵黄芪条件测定
菌种接种挨次对菌体生长的影响 取制备好的培育基 18 瓶，随机分为 1—6 组，每组 3 个重复，每个重复 3 瓶。按表 1 所示挨次组合将菌种分别在肯定的时间点按 %的接种量接种至培育基中，接种后培育时间均为 24 h，培育完毕后镜检各菌种的生长状况及 pH 值，接种的相应菌种生长用“√”表示，接种的相应菌种未生长用“-”表示。
表 1 菌种接种挨次 The inoculation order of strains 组别 Group 接种时间/h Inoculation time 024481 枯草芽孢杆菌酵母菌乳酸菌 2 枯草芽孢杆菌乳酸菌酵母菌 3 酵母菌枯草芽孢杆菌乳酸菌 4 酵母菌乳酸菌枯草芽孢杆菌 5 乳酸菌酵
母菌枯草芽孢杆菌 6 乳酸菌枯草芽孢杆菌酵母菌
枯草芽孢杆菌发酵时间对酵母菌生长的影响 承受单因子试验法，取制备好的培育基 15 瓶，随机分为 1—5 组，每组 3 个重复，每个重复 3 瓶。1—5 %接种量接入枯草芽孢杆菌[9]，分别在接种后的 24、36、48、60、72 h，取样测定枯草芽孢杆菌数量，同时各组均按 %接种量接入酵母菌，培育 24 h 后
测定酵母菌数量。
酵母菌最适接种量的测定 承受单因子试验法，取制备好的培育基 15 瓶，随机分为 1—5 组，每组 3 个重复，每个重复 3 瓶。1—5 组均按 %接种量接入枯
草芽孢杆菌，按 中所得最优培育时间进展培育后，各组分别按 %、%、%、%、%的接种量接入酵母菌，培育 24 h 后测定酵母菌的数量。
酵母菌发酵时间对乳酸菌生长的影响 承受单因子试验法，取制备好的培育基15 瓶，随机分为 1—5 组，每组 3 个重复，每个重复 3 瓶。1—5 组均按 %的接种量接入枯草芽孢杆菌，依据 中所得最优培育时间进展培育，然后均按
中所得最正确接种量接入酵母菌，分别在接种后的 24、36、48、60、72 h， 取样并测定酵母菌数量，同时各组均按 %的接种量接入乳酸菌，培育 24 h 后测定乳酸菌数量。
乳酸菌最适接种量的测定 承受单因子试验法，取制备好的培育基 15 瓶，随机分为 1—5 组，每组 3 个重复，每个重复 3 瓶。1—5 组均按 %的接种量接入枯草芽孢杆菌，依据 中所得最优培育时间进展培育，然后均按 中所得最正确接种量接入酵母菌，再依据 中所得最优培育时间进展培育后，各组分别按 %、%、%、%、%的接种量接入乳酸菌，培育 24 h 后测定乳酸菌的数量。
发酵时间对乳酸菌生长的影响 承受单因子试验法，取制备好的培育基 15 瓶， 随机分为 1—5 组，每组 3 个重复，每个重复 3 瓶。1—5 组均按 %的接种量接入枯草芽孢杆菌，依据 中所得最优培育时间进展培育，然后均按 中所
得最正确接种量接入酵母菌，再依据 中所得最优培育时间进展培育，最终各组均按 中所得最正确接种量接入乳酸菌，分别在培育 24、36、48、60、72 h 时，取样并测定乳酸菌数量。
中试扩大试验
为进一步确定上述摇瓶试验结果的有用性，利用 200 L 全自动不锈钢发酵罐及筛
选后的培育基进展中试扩大试验，并检测发酵液各菌种的数量和发酵终点 pH 值。培育基初始 pH 值为 ，装液量为 70%；枯草芽孢杆菌发酵温度为 37 ℃，接种量为 %，电机转速为 250 r/min，通气量为 m3/min；酵母菌发酵温度
为 28 ℃，电机转速为 250 r/min，通气量为 m3/min；其他发酵条件依据
中所得的最优结果执行。
活菌数量的测定
承受平板菌落计数法测定活菌数量[10]。取 1 mL 发酵好的菌液稀释至 10-6、10- 7、10-8 倍，取 1 mL 稀释液于无菌平板，然后参加适量琼脂培育基摇匀，待培育
基凝固后，在适宜温度下倒置培育 24 h，查出平板菌落数，测数样品设 3 个重复。依据公式：每毫升活菌数=平板上菌落数×稀释倍数，来计算发酵液中活菌总量。
枯草芽孢杆菌活菌数量的测定为：将发酵液置于 80 ℃水浴锅中 20 min，此后操
作同平板菌落计数法，测数培育基承受养分琼脂培育基，培育条件为 37 ℃有氧培
养；酵母菌测定承受马铃薯琼脂培育基(含氯霉素)，培育条件为 28 ℃有氧培育； 乳酸菌测数培育基承受莫匹罗星锂盐 MRS 琼脂培育基，培育条件为 37 ℃厌氧培育。
结果与分析
菌种接种挨次对菌体生长的影响
由表 2 所示，按 1、2 组的菌种接种挨次，3 种益生菌均能正常生长，按其他 4 组接种挨次，枯草芽孢杆菌不能生长。试验开头，依据表 1 的接种挨次，各组分别接种枯草芽孢杆菌(1、2 组)、酵母菌(3、4 组)和乳酸菌(5、6 组)，培育 24 h 后， 各组中菌体均能生长。pH 值以枯草芽孢杆菌组最高，分别为 和 ；酵母菌组次之，pH 值均为 ；乳酸菌组最低，pH 值分别为 和 。各组在24 h 时分别接入相应菌种(表 1)，培育 24 h 后，1、5 组(酵母菌)和 2、4 组(乳酸
菌)接入的菌种均能正常生长，以上各组 pH 值分别为 、、、；
3、6 组(枯草芽孢杆菌)接入的菌种未生长，pH 值分别为 和 。各组在 48 h 时接入相应菌种(表 1)，培育 24 h 后，4、5 组(枯草芽孢杆菌)未生长，其他各组接种的菌种正常生长，终末菌液均呈酸性，pH 值分别为 、、、、、，乳酸菌接种挨次在酵母菌之前组别(2、5、6 组)的 pH 值低于酵母菌接种挨次在乳酸菌之前的组别(1、3、4 组)。由于枯草芽孢杆菌和酵母菌均为需氧菌，除温度之外其他发酵条件全都，第 1 组的接种挨次在制剂制备时操作
便利，因此确定第 1 组为最正确接种挨次组合。
表 2 菌种接种挨次对菌体生长的影响 Effect of inoculation sequence on growth of strains 组别 Group 菌体生长状况及 pH 值 The growth condition of the strains and pH24 h 48 h72 h1√ √ √ √ √ √ √ - √ √ √ - √ √ - √ - √
注：“√”表示接种的菌种生长，“-”表示接种的菌种未生长。Note：“√” indicates the growth of the inoculated strain,and “-” indicates that the inoculated strain did not grow.
复合菌种分段发酵黄芪条件对各菌种生长的影响
枯草芽孢杆菌发酵时间对酵母菌生长的影响 由表 3 所示，检测得枯草芽孢杆菌在后续试验过程中活菌数量变化较小；当枯草芽孢杆菌培育时间为 24 h 时，接种的酵母菌在培育后获得的数量最高，为 ×108 cfu/mL，另外 4 组酵母菌数量在 ×108～×108 cfu/mL，随着枯草芽孢杆菌培育时间的延长酵母菌数
量呈下降趋势，说明延长枯草芽孢杆菌的培育时间能抑制酵母菌的生长。结果说明， 在枯草芽孢杆菌培育 24 h 时接种酵母菌，既能保证枯草芽孢杆菌得到充分的生长， 又能使酵母菌的菌体数量较高，因此，确定枯草芽孢杆菌培育 24 h 时为酵母菌的
最优接种时间。
表 3 枯草芽孢杆菌培育时间对酵母菌生长的影响 Effect of Bacillus subtilis
culture time on the growth of yeast 菌种 Strains 培育时间/h Culture time2436486072 枯草芽孢杆菌/108(cfu/mL)Bacillus 酵母菌
/108(cfu/mL)
接种量对酵母菌生长的影响 由表 4 所示，随着酵母菌接种量的提高，培育后所得酵母菌数量先上升后降低，以接种量为 %的试验组酵母菌数量最高，×108 cfu/mL，因此，确定酵母菌最正确接种量为 %。
表 4 接种量对酵母菌生长的影响 Effect of inoculating volume on the growth of yeast 菌种 Strains 接种量 Inoculation %%%%%酵母菌
/108(cfu/mL)
酵母菌培育时间对乳酸菌生长的影响 由表 5 所示，酵母菌数量随着培育时间的延长，活菌数量先上升后降低，以培育时间为 60 h 时的活菌数量最高，×108 cfu/mL；随着酵母菌培育时间的延长，后续接种并培育的乳酸菌数量先上升后降低，当酵母菌培育时间为 48 h 时，接种的乳酸菌培育后获得的数量最
高，为 ×108 cfu/mL。酵母菌培育 48 h 时乳酸菌数量为 ×108 cfu/mL， 虽然低于酵母菌培育 60 h 时的乳酸菌数量，但考虑到此时接种所得乳酸菌的活菌
数最高，且延长培育时间增加能耗，因此，确定酵母菌培育 48 h 时为乳酸菌的最优接种时间。
表 5 酵母菌培育时间对乳酸菌生长的影响 Effect of yeast culture time on Lactobacillus growth 菌种 Strains 培育时间/h Culture time2436486072 酵母菌/108(cfu/mL) 乳酸菌
/108(cfu/mL)
接种量对乳酸菌生长的影响 由表 6 所示，随着乳酸菌接种量的提高，培育后
所得乳酸菌数量先上升后降低，以接种量为 %的试验组乳酸菌数量最高，×108 cfu/mL，因此，确定乳酸菌的最正确接种量为 %。
表 6 接种量对乳酸菌生长的影响 Effect of inoculating volume on the growth of Lactobacillus 菌种 Strains 接种量 Inoculating %%%%%乳酸菌
/108(cfu/mL)
培育时间对乳酸菌生长的影响 由表 7 所示，随着培育时间的延长，乳酸菌数量呈降低趋势，以培育时间为 24 h 的乳酸菌数量最高，为 ×108 cfu/mL， 因此，确定乳酸菌最优培育时间为 24 h。
表 7 培育时间对乳酸菌生长的影响 Effect of culture time on the growth of Lactobacillus 菌种 Strains 培育时间/h Culture time2436486072 乳酸菌
/108(cfu/mL)
中试扩大试验结果
由表 8 所示，按上述试验所得最优发酵条件，调整培育基初始 pH 值为 ，发酵罐装液量为 70%，枯草芽孢杆菌接种量为 %，发酵温度为 37 ℃，电机转速为 250 r/min，通气量为 m3/min；枯草芽孢杆菌培育 24 h 后，以 %的
接种量接种酵母菌，电机转速为 250 r/min，通气量为 m3/min，于 28 ℃培
养 48 h；然后，以 %的接种量接种乳酸菌，于 37 ℃静置培育 24 h。检测发酵
液中各菌种的数量如下：枯草芽孢杆菌为 ×108 cfu/mL，×108 cfu/mL，乳酸菌为 ×108 cfu/mL，终末 pH 值为 。与前期摇瓶试验阶段相比，乳酸菌数有所降低，但枯草芽孢杆菌和酵母菌数量大幅提高，说明本争论利用复合益生菌液态发酵黄芪的方法具有良好的可行性。
表 8 中试扩大试验结果 Result of pilot test 工程 Item 枯草芽孢杆菌
Bacillus subtilis 酵母菌 Yeast 乳酸菌 Lactobacillus 活菌数
/108(cfu/mL)Number of living 3 结论与争论
本争论说明，利用多菌种能对黄芪提取液进展混合发酵，接种挨次为枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌；最优发酵条件为：枯草芽孢杆菌以 %的接种量于 37 ℃培育
24 h 后，以 %的接种量接种酵母菌，于 28 ℃培育 48 h 后，再以 %的接种量接种乳酸菌，于 37 ℃静置培育 24 h；按优化后的发酵条件，利用发酵罐进展中试试验，发酵完毕时，枯草芽孢杆菌、酵母菌、×108、×108、×108 cfu/mL，终末 pH 值为 。黄芪经益生菌混合发酵后，其作用效果与发酵之前或单一菌种发酵相比是否会有所提高，还需进一步争论。
分段复合发酵中菌种接种挨次对各菌种生长的影响
目前，关于多菌种复合发酵制备饲料添加剂或发酵型饲料原料的争论主要集中在利 用同类菌种的混合发酵，由于同类菌种生长生殖条件相像，混合发酵培育可行性强， 通过同类多菌种混合发酵能有效提高发酵液中活菌数量或发酵底物的品质。例如， 王玉燕等[11]利用 3 株乳酸菌混合发酵制备具有高活菌含量的发酵液，通过发酵条
件和培育基的优化，活菌数量可到达 ×1013 cfu/mL。利用不同种类的有益菌混合发酵亦有报道，李祖旭[12]用枯草芽孢杆菌、米曲霉、鼠李糖乳杆菌和长双歧杆菌发酵健胃消食片药渣得到的制剂，对脾虚小鼠肠道菌群具有肯定的调整作用； 王国强等[13]利用特别汉逊酵母菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌,以 2∶2∶1 的比例，5%的接种量，发酵豆粕 48 h，明显提高了豆粕的养分价值。由于不同种类的菌种发酵条件和养分需求不全都，假设在一样的发酵条件下，将不同种类的菌种同时接种至同一培育基中，再加上菌种在生长过程中可能产生相互抑制，将会导致某些菌种生长不充分甚至无法生长。肖萌[13]利用纳豆芽孢杆菌和乳酸菌分段接种的