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彭邦剑;黄文斌;赵娟娟;潘明
【摘 要】目的 肝细胞癌(HCC)是一种恶性程度很高的肿瘤,术后极易消灭复发转移, (CTCs)是存在于外周血循环中各类肿瘤细胞的统称,是导致 HCC HCC 患者外周血中富集到 CTCs,富集到的 CTCs 经过免疫荧光标记法、RNA 原位杂交法、流式细胞术、 HCC 中 CTCs 的富集与鉴定技术获得了较好的敏感性和特异性,在临床分期、预后评价和疗效评估等方面已经逐步开展相应的争论并取得了肯定成果.
【期刊名称】《山东医药》
【年(卷),期】2025(058)048
【总页数】4 页(P90-93)
【关键词】肝细胞癌;循环肿瘤细胞;富集技术;鉴定技术;临床分期;预后评价;疗效评估
【作 者】彭邦剑;黄文斌;赵娟娟;潘明
【作者单位】南方医科大学珠江医院, 广州 510280;南方医科大学珠江医院, 广州510280;南方医科大学珠江医院, 广州 510280;南方医科大学珠江医院, 广州
510280
【正文语种】中 文
【中图分类】
肝细胞癌(HCC)是临床最常见的恶性肿瘤之一，多数患者就诊时已处于中晚期，错过了根治性手术的最正确时机，即使可行手术治疗，术后也极易复发，预后较差。早觉察、早诊断、早治疗可明显提高 HCC 患者的生存时间和生存质量。甲胎蛋白(AFP)作为 HCC 最经典的血清肿瘤标志物，已在临床上普遍使用，但其敏感性和特异性都不令人满足。因此，查找敏感、特异的肿瘤标志物始终临床争论的热点。循环肿瘤细胞(CTCs)是存在于外周血循环中各类肿瘤细胞的统称，可自发或因诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落。大局部 CTCs 在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，只有极少数肿瘤细胞在循环系统中存活下来。由于其在人体外周血中含量极少，在大量的血细胞中富集并鉴定出这一类特别细胞格外困难。目前主要通过物理特性或生物学特性等从外周血中富集 CTCs，富集到的 CTCs 再经免疫荧光标记法、RNA 原位杂交法、流式细胞术、细胞的核质比例法进一步排解非CTCs。现已证明，CTCs 在肝癌、乳腺癌、肺癌等肿瘤血行转移过程中发挥关键作
用[1]。本文结合文献就 HCC 中 CTCs 的检测技术及其临床应用争论进展作一综述。1 HCC 外周血中 CTCs 检测技术
CTCs 在肿瘤患者外周血中含量极少，即使在的转移性肿瘤患者外周血中也存在很少，故从大量血细胞中富集并鉴定出这一类特别细胞格外困难。目前，临床上可用于富集 CTCs 的技术近百余种，其原理主要是基于 CTCs 的物理特性和生物学特性，但均无法避开血细胞污染。要进一步明确 CTCs 与肿瘤生物学的关系，避开其他细胞的影响，必需对富集的 CTCs 进展鉴定。目前常用的鉴定方法主要有基于免疫荧光标记法、RNA 原位杂交法、流式细胞术、细胞的核质比例法等。
CTCs 富集技术 基于 CTCs 物理特性的技术主要集中在尺寸大小、可塑性、密度梯度或介电性质等方面。由于 CTCs 密度比红细胞、中性粒细胞小，依据这一特
性，通过密度梯度离心的方法分别外周血中不同的细胞组分，这是早期分别 CTCs
的方法，目前已很少单独使用该方法富集 CTCs。商业化产品 CanpatrolTM 系统、ISET®系统和 ScreenCell®系统等利用具有肯定大小孔径的微孔滤膜富集 CTCs， 由于白细胞尺寸偏小且简洁形变，能通过微孔被去除，而 CTCs 尺寸较大且细胞骨架较硬，不易形变，很难通过滤膜而被截留下来。Qi 等[2]通过 CanpatrolTM 系
统从 112 例 HCC 患者(包含早期 HCC)外周血中富集 CTCs，其中 111 例患者富集到 CTCs。ApoStream®系统是利用电介质的差异来富集 CTCs，其在血液中捕获肿瘤细胞的效率超过 75%，其捕获的 MDA-MB-231 细胞的存活率高于 %， 并且培育至第 7 天时细胞生长没有差异。由于依据物理特性筛选 CTCs 易混杂其他血细胞，并且可能会遗漏掉局部肿瘤细胞，目前承受物理特性的方法富集 CTCs 的争论越来越少。
在生物学特性中，大多数方法是基于免疫亲和性，如免疫磁珠富集法、流式细胞术分选等。免疫磁珠富集法是指依靠细胞外表标志物，将抗体包被在磁珠外表成为免疫磁珠，主要分为正向富集和负向富集。CellSearch®系统承受正向富集的策略， 基于上皮细胞黏附分子(EpCAM)阳性 CTCs，将肿瘤细胞上皮标志物 EpCAM 抗体包被在磁珠外表，通过 EpCAM 抗体特异结合在 CTCs 外表，在外加磁场的作用下分选出 CTCs。Sun 等[3]承受 CellSearch®系统对 73 例承受 HCC 手术患者进展CTCs 分布模式争论，结果觉察，在外周静脉血、外周动脉血、肝静脉、肝后下腔静脉和门静脉中富集到 CTCs 的患者比例分别为 %、%、%、%和 %。负向富集是通过剔除血细胞的方法来分选 CTCs。Guo 等[4] 承受负向富集的方法结合多标志物组合模型对 60 例 HCC 患者外周血进展观看， 结果觉察术后 1 个月患者外周血 CTCs 明显下降。说明 CTCs 模型在 HCC 诊断中具有较高的敏感性和特异性，可作为风险推测和治疗监测的实时参数。此外，随着流式细胞术分选技术的进展，其也渐渐被用于 CTCs 富集。有争论觉察，流式细胞
分选技术检测 CTCs 在体外是可行的，并与 RT-PCR 检测结果全都，但其在体内检
测敏感性较差，与 RT-PCR 检测结果不全都，这使流式细胞术单独应用于 CTCs 富集受到了限制。但流式细胞术联合其他富集技术在 CTCs 提纯方面具有较好的效果， 为进一步在形态学、细胞学、遗传学等方面分析 CTCs 供给了根底[5]。D′Avola
等[6]描述了一种结合成像流式细胞仪和单细胞 RNA 测序(scRNA-seq)来识别患者CTCs 的方法，其利用 CD45 阴性富集去除白细胞，然后使用 IFC 选择 CTCs，最终进展 scRNA-seq，该系统捕获效率高达 65%，并且该系统获得的 CTCs 基因表达谱存在明显异质性，这或许可为共性化检测 CTCs 以及制定相关治疗方案供给方法。但到目前为止，基于 EpCAM 的 CellSearch®系统仍旧是惟一一个获得FDA(2025 年获批)和 CFDA(2025 年获批)批准,用于恶性肿瘤检测 CTCs 的商业化产品。
微流控芯片技术富集 CTCs 需要极少的血液数量，无论是基于物理特性还是生物学特性，均具有较高的敏感性，近年来受到越来越多关注。当外周血细胞流过微流控芯片时，目标抗体阳性的 CTCs 将会停留下来。有争论将配体-受体结合测定应用于微流体装置中的 CTCs 芯片，其在人造 CTCs 血液样品中的捕获率超过 85%， 在 36 例 HCC 患者中检测到的 CTCs 为(14±10)个/2 mL[7]。Qin 等[8]开发了一种型简洁的楔形微流体装置，用于高效分别癌症患者血液样本中的 CTCs，该方法对 HepG2、SKBR3、A549、BGC823 四种肝癌细胞表现出优异的分别性能(超过 85%的捕获效率)；在临床试验中，该平台鉴定的 HCC 患者外周血 CTCs 阳性
率为 %。类似地，HB Chip、GEM Chip 和 GO Chip 通过设计微管道的构造， 并在管道上包被 EpCAM 抗体，当外周血流经包被有 EpCAM 抗体的管道时，
CTCs 被捕获并固定在芯片外表上。目前，承受多种抗体组合模型的微流控芯片技术用于富集 HCC 患者外周血 CTCs 已经成熟，这种方法有力量去捕获那些EpCAM 低表达或者不表达的 CTCs，但这种方法必需找到适宜的标志物区分于非
CTCs，才能被临床应用。此外，Kalinich 等[9]介绍了一种高通量微流体的 CTC-
iChip，它能有效地从血液标本中消耗造血细胞，并为 CTCs 供给保存完好的 RNA， 可为后续下游形态学、免疫细胞学和遗传学等争论供给完整的细胞构造。
CTCs 富集技术多种多样，无论是基于物理特性还是生物学特性，都不能很好地解释遗漏 CTCs 或者白细胞污染的问题，多重富集技术的组合模型可能是将来的一条出路，但要如何将这些技术标准化、正规化是一个难点，信任不久的将来会有更多的 CTCs 富集方法或者组合模型消灭，为后续的 CTCs 与 HCC 转移复发等机制的争论开拓的道路。
鉴定技术 免疫荧光标记是最常用的一种 CTCs 鉴定技术，该技术主要基于细胞抗原-抗体反响来将 CTCs 区分于其他细胞，故适宜的荧光抗体或荧光抗体组合是关键。CellSearch®系统是使用该方法对 CTCs 进展鉴定，在这个平台上，通过使用一种核内染色剂(DAPI)来进展免疫组化染色，其中的荧光抗体可特异性反向结合 CD45，也可与 CK8、CK18、CK19(细胞质上皮标志物)结合。但有争论觉察， CTCs 在脱离肿瘤组织进入血液进展远处转移的过程中，会发生上皮-间质转化(EMT)。与其他上皮性肿瘤不同，大局部 HCC 细胞并不表达 EpCAM，这在肯定程度上限制了基于 EpCAM 技术在临床上的应用。Liu 等[10]使用一种基于磁珠负性富集的方法去除 CD45+白细胞，并改进了识别 CTCs 的标志物，该团队应用三种组合抗体——CD45-、去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)和氨基甲酰磷酸合成酶1(CPS1)来标记 HCC 外周血 CTCs，最终承受三重免疫荧光染色处理的方法，将目标细胞分选出来，结果在 91%(29/32)的 HCC 患者中检测到了 ASGPR 和
(或)CPS1+CTCs，而在其他肿瘤患者中未检测到，抗 ASGPR 和 CPS1 单克隆抗体的混合物比单独任一抗体鉴定 HCC 细胞的敏感性和特异性明显增加。此外，包括DAPI+、CD45-、ASGPR+、HspPar1+、DAPI+、CD45-、CK+、pERK/Akt+
等在内的标志物抗体组合也被用于 CTCs 的鉴定技术。
通过多重探针标记的 RNA 原位杂交法实现 CTCs 鉴定和分型也是常见的鉴定方法
之一。Canpatrol 系统[11]即是应用这一原理，该系统针对 EMT 途径，同时对上皮标志物(如 EpCAM、CK8、CK18、CK19)和间质标志物(如 Twist、Vimentin)进展检测。有争论说明，在 HCC 患者外周血中，间质型 CTCs 更多见于消灭转移患者的外周血样本中，并且存在的数量越多，提示患者预后越差[12]。Qi 等[2]应用该系统觉察，112 例 HCC 患者(包含早期 HCC)中有 111 例(%)CTCs 阳性； 另外，在 12 例乙型肝炎病毒感染患者中，有 2 例患者亦检测到 CTCs，这 2 例患者在 5 个月内均检测到微小 HCC。除了商业化产品 Canpatrol 系统外，Guo 等[4] 对 HCC 外周血首先承受 CD45 负性富集，然后利用 qRT-PCR 的方法对多标记物表征(EpCAM、CD133、CD90 和 CK19)的 CTCs 进展鉴定，结果觉察该鉴定技术在 HCC 的诊断中具有高度敏感性和特异性，可作为风险推测和治疗监测的实时参数。
免疫荧光标记法和 RNA 原位杂交法是目前常用的两种 CTCs 鉴定技术，但是这两种技术都高度依靠相应的标志物，表征 CTCs 标志物不同将直接导致 CTCs 鉴定的
敏感性和特异性不同。此外，基于流式细胞术、细胞的核质比例法等也有文献报道。Ogle 等[13]首先承受负向富集的方法剔除血细胞，剩下的细胞悬液承受流式细胞
成像术检测细胞角蛋白、EpCAM、AFP、磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3 和 DNA-PK，然后分析大小、形态和 DNA 含量，依此来鉴定 HCC 外周血 CTCs，结果觉察，%的 HCC 患者血液样本中检测到 1～1 642 个 CTCs。Guo 等[14]觉察了一种的策略来检测 HCC 外周血 CTCs，同样利用流式细胞仪分选，该系统基于 HCC 患者外周血细胞的核质比例联合生物标志物 EpCAM 和 CD45 分选 CTCs，而不是传统的单一标志物或者多标志物联合检测，结果觉察这个的 CTCs 鉴定方法更敏感和更牢靠。
CTCs 能否推测临床结局并进一步评估抗肿瘤药物的治疗效果，最终还要依靠
CTCs 鉴定技术是否准确牢靠。但至今关于 HCC 的 CTCs 检测仍旧没有统一标准，
其检测结果的准确性和牢靠性是 CTCs 在临床应用中面临的最大挑战，不断提高CTCs 检测技术并使之标准化成为了今后争论 CTCs 的重点。
HCC 外周血 CTCs 检测的临床应用
目前多种多样的富集方法和多分子靶标联合应用已经使得肝癌 CTCs 的富集与鉴定技术获得了较好的敏感性和特异性，在临床分期、预后评价和疗效评估等方面已经逐步开展相应的争论并取得了肯定成果。
临床分期 争论说明，外周血 CTCs 阳性率及肿瘤分期(BCLC 分期、TNM 分期) 呈正相关关系，有肉眼血管侵害及肝外转移患者体内 CTCs 阳性率更高。Schulze
等[15]应用 CellSearch®系统检测 HCC 外周血觉察，CTCs 计数与患者总生存率、BCLC 分期、微血管侵害、AFP 等亲热相关，这与 Sun 等[1]报道根本全都。CTCs 分为上皮型、混合型、间质型三种，不同表型的 CTCs 能从不同方面反映 HCC 患
者临床特征，可作为评估 HCC 患者病情的关心指标。应用 CellSearch®系统检测HCC 外周血 CTCs 时还觉察，在很多 TNM 分期提示为早期 HCC 患者外周血中也能检测到 CTCs[8]，这从侧面反映 HCC 早期即有可能进展为全身性疾病，仅仅依靠现有的临床分期不能真实反映 HCC 的生物学特点。因此，如果能够将 CTCs 应用于常规检查，如同乳腺癌一样纳入 NCCN 指南将会有利于 HCCs 患者的早期诊断，并能监测患者预后，进而延长患者的生存期。
预后推断 Sun 等[1]首次描述了在 HCC 患者中使用 CellSearch®系统检测EpCAM 阳性 CTCs，认为术前 CTCs 计数≥2 是 HCC 患者术后复发的推测因子。有文献报道，CTCs 计数与 HCC 患者不良临床病理特征相关，并且可能预示患者预后不良，Sun 等[16]的荟萃分析也证明白这一结论。Wang 等[12]采集了 62 例行根治性切除术后 HCC 患者外周血 5 mL，承受 CanPatrol 系统进展分析，觉察切除术后总 CTCs、混合型 CTCs 和间质型 CTCs 复发率明显增高，而上皮型 CTCs
复发率没有差异。Ou 等[17]应用 CanPatrol 系统在根治性手术前从 165 例 HCC
患者获得外周血样品检测 CTCs，结果说明间质型 CTCs 的存在提示最短的无复发生存率，其次是混合型 CTCs，然后是上皮型 CTCs，这与 Wang 等[18]报道根本全都。
疗效评估 CTCs 的检测在评价分期及预前方面已有大量文献报道，然而在监测疗效方面相对较少。Shen 等[19]评估了 EpCAM 阳性 CTCs 计数在推测不能切除的 HCC 患者经导管动脉化疗栓塞后死亡风险，将 89 例患者分为 3 组，即低度组(CTCs 计数为 0～1)、中度组(CTCs 计数为 2～5)和高度组(CTCs 计数≥6)，结果觉察高、中度组死亡风险分别为低度组的 (95% CI：～)、 倍(95% CI：～)。Guo 等[4]对多标记物表征的肝细胞特征 CTCs 进展大样本争论，结果证明其在 HCC 中具有高度敏感性和特异性，可作为风险推测和治疗监测的实时参数，肿瘤切除后 CTCs 负荷持续高值患者具有明显复发倾向，可早期制定有效的抗肿瘤策略。此外，包括 pERK 和 pAkt，EMT 标志物(Twist 和波形蛋白)，MAGE-3 和生存素，CK、EpCAM 和 Glypican-3，膜联蛋白 V、EpCAM、ASGPR1 和 TAMPs 等多标记组合的 CTCs 检测也可用于评估转移、预后以及监测药物治疗效果。
综上所述，CTCs 分析可能为临床医生和争论人员供给共性化策略，由于 CTCs 是敏感的生物标志物，有望在早期诊断、预后评价、实时监测和药物耐药等方面发挥重要作用，以促进精准医学的实施。因此，进一步筛选高存活力、高转移性的肝癌CTCs 子集，是深入争论 HCC 靶向转移机制的关键一步。然而，在临床上应用
CTCs 分析前，必需建立一种能够捕获全部 CTCs 高敏感性和特异性的方法。目前， 大多数争论是单中心病例比照争论，样本量有限，今后需要进展足够样本量和长期 随访的多中心前瞻性争论，以评估 CTCs 检测和鉴定方法，以便 CTCs 更好地用于HCC 临床分期、预后评价和疗效评估等。
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