高效液相色谱仪HPLC使用资料点滴.pdf

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高效液相色谱仪使用点滴
二、WatersHPLC2695 分离单元使用操作
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1、开机自检
打开电源开关，仪器开始自检（4～5min），待屏幕上方出现
“Idle”字样表示自检成功。
2、脱气（Degas）
按面板右下方“Menu/Status”键进入“Status（1）”界面，
移动光标
至“Degasser Mode”，按 Enter 选择“On”，打开在线脱气。
注意： 自动脱气机？
（1） 在开启除气装置时，要确认所有溶剂管路都充满溶剂；若没有
溶剂时请执行溶剂的 Dry Prime 动作。
（2） 当溶剂流速为 时，一定要关闭除气装置，不然可能会过度
真空使除气槽(vacuum chamber)破裂，而造成移动相外流出
来.
（3） 当溶剂的管子是空的时候，或是更换溶剂的时候，先执行 Dr
y Prime。按 “Menu/Status” 键，进入 Status (1)画面，按 “D
irect Function” 功能键，选择 Dry Prime，按 Enter。
（4） 冬天脱气时，室温应大于 10℃。
3、设定柱温（可选项） : .
在“Status（1）”界面，移动光标至“Col Htr Set”，输入
目标温度按 Enter 即可（可在工作站方法中设置）。
注意： 设定温度应高于室温 5℃低于 60℃。

4、Prime Seal Wash（清洗柱塞杆）
按“Menu/Status”键回到“Menu”界面，按下排功能键“Di
ag”，然后再按下排功能键“Prime Seal Wsh”，按“Start”键，
冲洗 1~2min 后，先按“HALT”键，再按“CLOSE”键，结束柱
塞杆的清洗。
注意：
（1） 清洗柱塞杆的溶剂可以用水，或 5%-10%甲醇（抑菌）。
（2） 可以每天开机后进行，或结束实验时进行。流
动相中有盐，结束实验时一定要清洗，仪器不
自动进行。

5、Wet Prime
在“Status（1）”界面中“Composition”下，选择将用到的溶
剂通道为“100%”，按液晶屏幕右下角“Direct Function”键，移
动光标选择“2 Wet Prime”，“OK”，流速及时间可使用默认值，
也可自行设定（如：5ml/min，3min），“OK”即可。
将每一个会用到的溶剂通道按照上述操作一次。
6、Purge Injector（注射器排气泡及清洗）
进入“Direct Function”界面后，选择“3 Purge Injector”，
“OK”，默认数值为 6，“OK”。
7、Prime Needle Wash（清洗注射针） : .
按“Menu/Status”键回到“Menu”界面，按下排功能键“Di
ag”，进入“Diagnostics”界面，按下排功能键之“Prime Ndl Ws
h”，按“Start”键，默认 30 秒钟，按“Close”键，即可返回“D
iagnostics”界面。
注意：
（1） 以上 4～7 操作步骤为溶剂系统前处理过程，建议每天开机
后依次进行。
（2） 若发现注射器中有气泡，则可重复 6 的操作步骤直至排除。

（3） 如果流动相中含有盐类，则实验结束后必须用水清洗柱塞杆
．．
（即操作 4）。
8、平衡柱子
在“Status（1）”界面上，按流动相比例设定各通道溶剂比例
后，再 Wet Prime 操作一次，然后设置流速，平衡色谱柱 30～60
min。
9、放置样品
拉开样品转盘舱门，将盛有待测样品溶液的样品瓶放入转盘中，
记下样品瓶号，关上舱门。
10、检测样品
打开工作站，设置仪器方法、方法组、自动进样序列等，监视
基线、检测样品。
11、分析处理数据、打印报告
12、清洗注射器、针、柱塞杆
参见上述 4、7 的操作步骤。 : .
13、清洗色谱柱
用水冲洗柱子 40-60min（视柱子规格不同，流速通常 1ml/min）；
然后用甲醇或乙腈冲洗柱子 40min（流速 1ml/min）。
14、关机
关掉电源开关。

氨基柱是同时可以用于正相条件和反相条件的，
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这一点很多用户都已经知道；但是要注意到的是：正相溶剂和反相溶剂往往是不互溶的，对这一点的
忽略可能会带给使用者一些麻烦。对于新购买到的柱子，首先请注意打开分析测试说明书，了解柱子的保
存溶剂。如果保存溶剂与你将要使用的流动相极性不同不会互溶，请先用异丙醇过渡。过渡过程中注意因
异丙醇粘度较大，会导致柱压很高，适当调低流速即可。如果要使用的流动相中还含有缓冲盐类，建议在
用分析流动相之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，这样可避免缓冲盐在分析柱内的析出。柱效检
测：我用于判断一个用户是否有经验的指标之一，是用户是否习惯配制一些柱效检测标准溶液。说到柱效
检测，我可以向大家提供一个方法，而且很通用，你也可以用同样的标准溶液和流动相来检测硅胶柱和氰
基柱。 流动相： 10％乙酸乙酯＋90％正己烷 流速 标准溶液：乙苯（如乙苯找不动就用甲苯代替呗）
＋苯甲酸甲酯检测波长 254nm 这个方法特别适用于新购柱子（新购柱子往往保存在正相溶剂中）时即进
行检测，如有问题，可及时与供应商沟通。也适合在柱子在准备放置相当长一段时间之前进行充分清洗后
进行检测作为记录留档。在平常的使用过程中，如果分析物是固定重复的，我们当然可以从对分析物的分
离分析情况来作出判断；但如果分析物和分析条件不同时，定期检测柱效可以避免柱效下降导致分离不佳
再分析查找原因这样浪费人力物力的过程。不过特别要注意的是，当氨基柱（或氰基柱）在反相条件中使
用时，如用该条件检测，请注意流动相的换相过渡问题。 氨基柱的使用：需要注意的是，氨基柱的键合官
能团氨丙基要比 C18,C8 柱的键合官能团 C18,C8 要容易水解，所以首先要做好其使用寿命稍逊的心理准备，
特别是当你的使用条件是反相条件下时。 反相条件下使用时，要特别注意控制 PH 值范围，PH 值越低越
有发生水解的危险，流动相中水的比例越高当然也越有发生水解的危险。所以，在使用后以及准备长时间
放置该柱时，必要的清洗和将氨基柱保存于纯的有机溶剂中是很好的保养措施。 有一种情况是，当使用氨
基柱进行酸性物质如果汁的分析时（分析其中的糖份），酸性物质的存在意味着质子的存在，可能会使略
带负电荷的氨基官能团质子化，导致使用一段时间后对于某些类的分析物保留性质有所改变或表现在柱效
下降。这时，Kromasil 专家所给的建议是：用 5-10 倍的柱体积的含 -％NH3 的 50-50 乙腈-水溶液冲
洗该柱（冲洗后当然要再用不含碱的流动相洗去多余氨），之后再进行分析这类酸性分析物时建议在流动
相中略微添加少许氨如 ％。 氨基柱的清洗简单说起来，正相条件下使用的氨基柱你就参照硅胶柱的清
洗方法；反相条件下使用的氨基柱你就参照 C18 的清洗方法。 平时在正相条件下使用：首先用 50 倍柱体
积的异丙醇清洗，因异丙醇粘度较大可适当放低流速；之后，用50 倍的甲醇清洗；之后，用异丙醇过渡回
到平常使用的正相流动相，即可。 平时在反相条件下使用：缓冲盐应及时冲洗，以及不能直接用纯甲醇冲 : .
洗缓冲盐等，属常识就不作特别交待了。用50 倍纯甲醇冲洗；之后，用异丙醇过渡后，用二氯甲烷冲洗色
谱柱；之后，再用异丙醇过渡回来到甲醇条件下。 这些清洗方法，主要是针对当样品中有杂质逐步吸附累
积到填料上时的处理方法，色谱柱表现行为为诸如柱压增高柱效降低等
LUNA 氨基柱的使用方法
1. 氨基柱既可以正相使用，也可以反相使用，但是要注意到的是：正相溶剂和反相溶剂往往是不互溶的，
正常情况新氨基柱保存在正相环境中，例如 LUNA 氨基柱保存在正己烷-乙腈（99：1）中。
2. 正相使用
新柱子可直接用流动相。推荐先用正己烷-乙腈（99：1）以 的流速冲 10 倍柱体积，再根据
流动相选用极性相近的氯仿或二氯甲烷以相同的流速冲 10 倍柱体积，最后换成流动相。
正相使用时，不宜分析含醛基、羰基的化合物，不可用于还原糖的分析；流动相要彻底脱气，并不得
含有羰基化合物和过氧化物（质量不好的 yi 醚、四氢呋喃含有少量）。
任何时候更换流动相时都要确保新流动相与柱子原保存液可互溶。
3 反相使用
先用正己烷-乙腈（99：1）以 的流速冲 10 倍柱体积，再依次以相同的流速相同的用量用氯
仿、异丙醇、甲醇、甲醇-水（50：50）冲柱子。
以 的流速用 30 倍柱体积的 的氢氧化钠（LUNA）水溶液冲柱子（注意 pH 值切不可
超过 ），立即用水（ 的流速，30 倍柱体积）冲洗，再换成流动相。
配制流动相时，应各组分分别量取，比例较小的组分要精密量取，需调 pH 值时要精密到 。
反相条件下使用时，要特别注意控制 pH 值范围，pH 值越低越有发生水解的危险，流动相中水的比例
越高当然也越有发生水解的危险。最理想的 pH 范围在 pH -
如果要使用的流动相中还含有缓冲盐类，建议在用分析流动相之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相
过渡，这样可避免缓冲盐在分析柱内的析出。
有一种情况是，当使用氨基柱进行酸性物质的分析时，酸性物质的存在意味着质子的存在，可能会使
略带负电荷的氨基官能团质子化，导致使用一段时间后对于某些类的分析物保留性质有所改变或表现在柱
效下降。建议：用 5-10 倍的柱体积的含 -％NH3 的乙腈-水(50:50)溶液冲洗该柱（冲洗后当然要再
用不含碱的流动相洗去多余氨），之后再进行分析这类酸性分析物时建议在流动相中略微添加少许氨如 0.
1％。
4 色谱柱的冲洗：简单说起来，正相条件下使用的氨基柱就参照硅胶柱的清洗方法；反相条件下使用的氨
基柱就参照 C18 的清洗方法。
5 色谱柱的保存
正相使用时，将柱子冲洗干净后，用正己烷-乙腈（99：1）保存。
反相使用时，如短期不用，可用甲醇或乙腈保存；长期不用时需将甲醇依次用异丙醇、氯仿置换，最
后用正己烷保存。
6 色谱柱的再生
方案 1：依次用甲醇、异丙醇、氯仿、正己烷、氯仿、异丙醇、甲醇冲柱子（各以 的流速，
20 倍柱体积），再换流动相。这些清洗方法，主要是针对当样品中有杂质逐步吸附累积到填料上时的处理
方法，色谱柱表现行为为诸如柱压增高柱效降低等。
方案 2：NH2 柱用于反相条件时，NH2 键会水解，尤其是在该柱子 pH 范围以外，在极端酸性和碱性
条件下柱寿命会下降很快，如果在这个条件下使用需要清洗一下，需要用 10 倍柱体积溶液冲洗，如下：
95％水/5％乙腈
THF 四氢呋喃
95％乙腈/5％水
并保持 95％乙腈/5％水继续冲洗，以低流速 - 过夜冲洗。 : .
方案 3：柱子使用一定时间后，柱效下降，老化，也可清洗一下柱子恢复柱性能,清洗时依次用 10 倍柱
体积的下列溶液冲洗：
95％水/5％乙腈
THF 四氢呋喃
95％乙腈/5％水
再走流动相即可

2695 运行过程中，两种流动相切换过程中压力忽高忽低，是怎么回事？
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切换流动相的时候先 wet prime 一