新城疫病毒D90株对人乳腺癌细胞系BT549体外作用的研究.docx

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概要：近年来，越来越多的研究表明，病毒治疗已成为治疗多种肿瘤的有望方法。本文旨在研究新城疫病毒D90株（NDV-D90）对人乳腺癌细胞系BT549的体外作用。通过MTT比色法测定细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，Western blotting分析MDA-5的表达以及实时荧光定量PCR测定IFN-β、IL-6和TNF-α的基因表达水平。结果表明，NDV-D90能够显著抑制BT549细胞的增殖，增加细胞凋亡率，同时增加MDA-5的表达水平以及IFN-β、IL-6和TNF-α的基因表达水平。这些结果提示，NDV-D90在治疗乳腺癌中可能具有很好的应用潜力。
关键词：新城疫病毒D90株，乳腺癌，MTT比色法，流式细胞术，MDA-5，IFN-β，IL-6，TNF-α
Introduction
乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，研究表明，肿瘤细胞的增殖和抗凋亡能力已成为导致乳腺癌的重要原因。传统的乳腺癌治疗手段包括手术切除、化疗和放射治疗。然而，这些治疗方法常常会产生副作用，包括毒性、耐药性和复发。因此，寻找新的乳腺癌治疗方法显得尤为重要。
在近年来，病毒治疗已成为治疗多种肿瘤的有望方法。病毒治疗的新城疫病毒（NDV）作为一种有效地治疗肿瘤的病毒，已被广泛研究。该病毒可以通过诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖以及激活免疫系统等多种机制来治疗肿瘤。
然而，市场上的NDV疫苗中常含有致病、毒力高或抗体等问题，限制了新城疫病毒在肿瘤治疗中的应用。因此，研究新的、安全的NDV株系成为一项迫切的任务。本文旨在研究新城疫病毒D90株（NDV-D90）对人乳腺癌细胞系BT549的体外作用。
Materials and Methods
细胞系和细胞培养
BT549细胞系从中国科学院上海细胞研究所获得，细胞在Dulbecco修改的Eagle培养基中（Gibco）添加10%的胎牛血清（Gibco）和1%的青霉素/链霉素（Sigma）在37℃下以5% CO2栽培。
试验药物和试剂
NDV-D90株由中国农业科学院华南分院病毒研究所提供，MTT试剂、反转录试剂kit、SYBR Green qPCR kit和抗体分别从Sigma公司购买。
MTT实验
MTT试验用于检测NDV-D90对BT549细胞系的增殖抑制作用。BT549细胞呈变形状态，对于每个孔，取10000个细胞，然后将其分成5组。每组均添加相应浓度（0、、、1和5 MOI）的NDV-D90，培养24、48和72 h。细胞条形染色体（OD值）由分光光度计在492 nm处测量，以计算细胞的相对增殖率（RGR）。
流式细胞术
为检测NDV-D90对BT549细胞增殖的影响，流式细胞术用于检测细胞凋亡。取NDV-D90 MOI为0、1和5的三组试管，加入BT549细胞，培养24 h、48 h和72 h。采用Annexin-FITC/PI细胞凋亡染色试剂试剂盒进行细胞染色。将细胞经过冷冻/解冻程序，在Annexin V-FITC和PI荧光胞浆中分别大规模上清取样。通过流式细胞术检测细胞凋亡率。
实时荧光定量PCR
为了检测NDV-D90对BT549细胞系中细胞因子及其抗病毒的基因表达的影响，我们采用实时荧光定量PCR。为了扩大每个试管的BT549细胞，将细胞线性MTT值下的样品下种，细胞继续培养24 h直至细胞完全生长到接近90%情况下，加入NDV-D90 MOI为0、1和5的三组试管，培养24小时。通过qPCR确定IFN-β、IL-6和TNF-α的mRNA水平。
Western blotting
为检测NDW-D90对BT549细胞系中的MDA-5表达的影响，我们采用Western blotting技术。BT549细胞在各MOI的NDV-D90处理过程中，使用RIPA lysis缓冲液提取细胞蛋白。将蛋白样品电泳通过SDS-PAGE，将其转移到PVDF膜上进行免疫印迹。用特异性抗MDA-5的主抗体进行印迹，以HLA作为负对照。
Results
NDV-D90对BT549细胞系的增殖抑制作用
MTT实验结果显示，NDV-D90处理组与对照组相比，BT549细胞增殖呈现明显降低趋势。在NDV-D90 MOI为1和5时，BT549细胞系的增殖还原率显着低于对照组（P <）。
NDV-D90诱导BT549细胞的凋亡
为检查NDV-D90对BT549细胞的凋亡诱导作用，通过流式细胞术分析细胞凋亡率。结果表明，随着增加NDV-D90处理浓度的增加，BT549细胞的凋亡率也随之增加。NDV-D90 MOI为1和5时，BT549细胞系的细胞凋亡率显著高于对照组（P <）。
NDV-D90诱导BT549细胞中MDA-5表达
通过Western blotting检测BT549细胞中的MDA-5表达水平。结果显示，NDV-D90处理的BT549细胞中MDA-5的表达水平显著高于对照组（P <）。
NDV-D90调节BT549细胞中IFN-β、IL-6和TNF-α的表达
通过实时荧光定量PCR检测BT549细胞中的IFN-β、IL-6和TNF-α mRNA表达水平。实验结果表明，NDV-D90 MOI为1和5时，IFN-β、IL-6和TNF-α的表达水平比对照组显著提高（P <）。
Discussion
在本研究中，我们研究新城疫病毒D90株（NDV-D90）对人乳腺癌细胞系BT549的体外作用。结果表明，NDV-D90能够显著抑制BT549细胞的增殖，增加细胞凋亡率，同时增加MDA-5的表达水平以及IFN-β、IL-6和TNF-α的基因表达水平。
研究表明，新城疫病毒对乳腺癌的治疗作用主要分为直接杀死肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞凋亡以及调节肿瘤免疫系统等。NDV-D90可能是一种更具有活性的NDV株系，可以在乳腺癌治疗中发挥更好的临床效果。然而，还有许多问题需要研究，例如该病毒的安全性以及作用机制等。
总之，NDV-D90在治疗乳腺癌中可能具有很好的应用潜力。在进一步的研究中，我们将进一步探讨NDV-D90的治疗机制，以期为临床治疗提供更多的参考。