分子生物学讨论人类基因组DNA提取.ppt

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人类DNA基因组提取分子生物学第一次讨论
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蒋伯岳 朱之苑 崔增桢
人类基因组DNA提取的原理
哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA，除特殊要求外，白细胞、肝或脾组织是最常用的材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞；有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。产前诊断所用的材料则为胎儿的羊水细胞或者绒毛膜细胞。
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人类基因组DNA提取的原理
人类基因组DNA提取应考虑以下原则：
防止和抑制DNase对DNA的降解；
尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏，保持DNA分子的完整；
将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。
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人类基因组DNA提取的原理
DNA整体表现为酸性，带负电。是极性化合物，微溶于水，不溶于乙醇，苯酚，氯仿，乙醚等有机溶剂，形成沉淀。从而被分离提取出来。
蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀，从而被除去。
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人类基因组DNA提取的方法
从全血中提取
从口腔上皮脱落细胞，发根细胞中提取
从胎儿的羊水细胞或者绒毛膜细胞中提取（常用于产前诊断）
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酚醇法从全血中提取DNA
葡聚糖悬浮法分离抗凝全血中的白细胞: mL 4%葡聚糖溶液于试管中，将5 mL新鲜抗凝全血加于葡聚糖溶液之上，净置30 min后，吸取黄色上清〔白细胞悬液)，离心得白细胞，洗涤。
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酚醇法从全血中提取DNA
在5 mL 15 mmol/L TES溶液中悬浮白细胞，加蛋白酶K 250一350 微克，10% SDS 260微升，充分混匀，置37℃过夜。
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酚醇法从全血中提取DNA
冷却至4 ℃加等体积Tris饱和酚，充分混匀，4 ℃ 3 000 r/min离心30 min吸取上层溶液移至另一离心管。加等体积Tris饱和酚，重复上一步Tris饱和酚抽提。
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酚醇法从全血中提取DNA
加等体积氯仿/异戊醇，充分混匀，4 ℃3 000 r/min离心5 min，吸取上层溶液移至另一离心管。重复数次。
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，轻摇至DNA析出。用75%冷乙醇清洗3一4次。加适量TE溶液溶解DNA。鉴定DNA。
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试剂作用
EDTA：是一种血液抗凝剂，同时抑制核酸酶活性，防止DNA被水解。
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SDS：10% （W/V）十二烷基硫酸钠：是一种去污剂，能导致蛋白质变性，从而破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。
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酚：是蛋白质的变性剂，并将变性的蛋白质溶解其中。而DNA则溶解于水相。
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氯仿：是蛋白质的变性剂，促进两相分离，并除去DNA溶液中的酚。
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