高纯度质粒小提中量试剂盒操作方法及步骤说明书.docx

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高纯度质粒小提中量试剂盒名目号：PL1801
适用范围：
适用于 5-15ml 中等规模质粒制备〔mind preparations〕 试剂盒组成、储存、稳定性：
试剂盒组成保存 50 次平衡液室温 5ml
RNase A〔10mg/ml〕－20℃250μl 溶液 P1 4℃25 ml
溶液 P2 室温 25 ml 溶液 P3 室温 35 ml
去蛋白液 PE 室温 16ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇漂洗液 WB 室温 15 ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇洗脱缓冲液 EB 室温 10ml
吸附柱 AC 室温 50 个
收集管〔2ml〕室温 50 个
本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。储存事项:
第一次使用时，将试剂盒所带的全部 RNase A 参加溶液 P1 后
〔终浓度 100ug/ml〕
置于 2-8℃保存。假设溶液 P1 中 RNase A 失活，提取的质粒可能会有微量 RNA
残留，在溶液 P1 中补加 RNase A 即可。
环境温度低时溶液 P2 中 SDS 可能会析出浑浊或者沉淀，可在
37℃水浴加热几分
钟，即可恢复澄清，不要猛烈摇摆，以免形成过量的泡沫。
避开试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH 值变化，各溶液使用后应准时
盖紧盖子。产品介绍：
本试剂盒承受改进 SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒 DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最终低盐、高pH 值的洗脱缓冲液将纯洁质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。
产品特点：
离心吸附柱内硅基质膜全部承受进口世界著名公司特制吸附膜， 柱与柱之间吸附
量差异微小，可重复性好。抑制了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
独有的去蛋白液配方，可以高效去除残留的核酸酶，即使是核酸酶含量丰富的菌
株如 JM 系列、HB101 也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。
快速、便利，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的
质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、 PCR、体外转录、测序等各种分子生物学试验。
留意事项
全部的离心步骤均在室温完成，使用转速可以到达 13,000rpm 的传统台式离心机，
如 Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
溶液 P3 和去蛋白液 PE 中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避开沾染皮肤、
眼睛和衣服。假设沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
提取质粒的量与细菌培育浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般
高拷贝质粒，建议
取 5-15 ml 过夜培育 14-16 个小时的菌液，可提取出多达 50μg- 60μg 的纯洁质粒。
假设所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb 的大质粒，应适当加大菌体使用量，使用 10-20 ml 过夜培育物，同时按比例增加 P1、P2、P3 的用量，其它步骤一样。
得到的质粒 DNA 可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260
值为 1 相当于大约 50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为 2 条或者多条 DNA 条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培育时间长短、提取时操作猛烈程度等有关。本公司产品正常操作状况下根本超螺旋可以超过 90%。
质粒 DNA 精准分子大小，必需酶切线性化后，比照 DNA 分子量 Marker 才可以知
道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其精准大小。
洗脱液 EB 不含有螯合剂 EDTA，不影响下游酶切、连接等反响。也可以使用水洗
脱，但应当确保 pH 大于 ，pH 过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应当保存在－20℃。质粒 DNA 假设需要长期保存，可以用 TE 缓冲液洗脱〔10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 〕，但是 EDTA 可能影响下游酶切反响，使用时可以适当稀释。
关于平衡液的使用
介绍：核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷 / 尘埃发生反响而影
响其核酸的结合力量。硅胶柱经平衡液预处理后可大大削减柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合力量。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液，假设不留神遇到，请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖，以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成，请加热至 37℃使沉淀完全消逝。
使用方法：取一个的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取100μl 的平衡液至柱
子中。13000 rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重放回收集管。
此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。操作步骤：〔试验前请先阅读留意事项〕
提示：
第一次使用前请先在漂洗液 WB 和去蛋白液 PE 瓶中参加指定量无水乙醇，充分混匀，参加后请准时在方框打钩标记已参加乙醇，以免 屡次参加!
将 RNase A 全部参加溶液 P1 中，混匀，每次使用后置于 2-8℃ 保存。
将溶液 P3 放在冰上预冷。
取 5-15 ml 过夜培育的菌液，9,000rpm 离心 1-2 分钟，尽可能的倒干上清，收集
菌体。
用 500μl 溶液 P1 重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮，全部转入一个 2ml 离心管。
假设有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。 500μl 的溶液 P2，温顺地上下翻转 4 -7 次使菌体充分裂解，
室温放置 4 分钟。
温顺地混合，不要猛烈震荡，以免基因组DNA 剪切断裂！所用时间不应超过 5 分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，
假设菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是肯定要准确的 5 分钟。
加 700μl 溶液 P3，马上温顺地上下翻转 4 -7 次，充分混匀时会消灭白色絮状沉淀。
冰上静置 3-5 分钟，13,000rpm 离心 10 分钟，留神取上清。
参加溶液 P3 后应当马上混匀，以免产生 SDS 的局部沉淀。假设上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
平衡液预处理吸附柱：
使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤，具体方法参见前文“关于平衡液的使用”
将上一步所得上清分次参加吸附柱 AC 中〔吸附柱放入收集管中〕，13,000rpm 离
心 30-60 秒，倒掉收集管中的废液。
可选步骤:参加500μl 去蛋白液PE，13,000rpm 离心30-60 秒， 弃废液。
此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用菌株为 JM 系列、HB101 等 endA 菌株或野生型菌株，核酸酶含量丰富，应加此步骤； 如所用菌株为 XL-1 Blue 和 DH5α 等缺陷型菌株，核酸酶含量低，则可略过此步骤。
参加 600μl 漂洗液 WB〔请先检查是否已参加无水乙醇 !〕，
12,000rpm 离心 30 秒， 弃掉废液。
参加 600μl 漂洗液 WB，12,000rpm 离心 30 秒，弃掉废液。
将吸附柱 AC 放回空收集管中，13,000rpm 离心 2 分钟，尽量除去漂洗液，以免
漂洗液中残留乙醇抑制下游反响。
取出吸附柱 AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加 100μl-250 洗
脱缓冲液 EB〔洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中加热效果更好〕， 室温放置 2-5 分钟，12,000rpm 离心 1 分钟。假设需要较多量质粒，
可将得到的溶液重参加离心吸附柱中，离心 1 分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高。假设需要质粒浓度较高，可以适 当削减洗脱体积，但是最小体积不应少于 80μl，体积过小降低质粒洗脱效率，削减质粒产量。
问题与解决方法问题评论与建议
质粒 DNA 产量低*忘加抗生素，非质粒转化细胞过度生长-建议：
确保固体、液体培育基中都参加了适当的抗生素。
*细菌培育时间太长，老化细菌开头裂解 -建议：接种过夜培育的颖单菌落于加了适宜抗生素的培育基中，培育 12-16 个小时。
*使用了低拷贝数质粒-建议：使用高拷贝数质粒，低拷贝数质粒应当适当加大处理体积。
*细菌培育时间过短，细菌浓度过低 -建议：细菌培育到 [A600]吸光值为 2-4 时，收集菌体。
*细菌细胞裂解不完全-建议：使用建议的菌体处理量，不要过量； 涡旋或者吹打，确保菌体充分重悬于溶液 P1 中，不应当见到未散开的细菌团块；参加裂解液 P2 后，应当是粘稠和透亮的。
*质粒 DNA 产量使用分光光度计定量不准确-建议：分光光度计定量常常偏高，使用琼脂糖电泳/EB 染色定量。
*洗脱效率不高-建议：请阅读操作步骤 9 和留意事项 6。
未提取到质粒 DNA *漂洗液 WB 中忘加无水乙醇-建议：第一次试验时，在漂洗液 WB 中参加指定量无水乙醇
*质粒洗脱液含有较多乙醇，琼脂糖电泳/EB 染色定量时质粒 DNA 漂出上样孔-建议：确保已经做了步骤 9，将离心吸附柱的残留乙醇去除；或者适当提高上样缓冲液浓度。。
问题评论与建议质粒 DNA
下游酶切不能
切开或者酶切不完全*遗忘做步骤 9，乙醇抑制了酶切反响-建议： 做步骤 9，然后空气中晾几分钟，让残留乙醇挥发。
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来，抑制了酶切反响 -建议：将洗脱的回收 DNA 溶液 13,000rpm 再离心 1 分钟，留神取上清使用。
质粒 DNA 降解或者无质粒 DNA *核酸酶活性太高-建议：确保已经做了步骤 6，使用去蛋白液 PE 去除核酸酶。
基因组 DNA 污染*裂解时基因组 DNA 被剪切打断了-建议：做步骤 3 时，轻柔颠
倒混匀，不要涡旋或者猛烈震荡。
质粒 DNA 缺口或者电泳时超螺旋带前消灭变性质粒带
*步骤 3 裂解时间过长-建议：裂解时间不要超过 5 分钟。
产物中含有RNA 污染*第一次做试验时，遗忘将RNase A 参加 P1 溶液，RNase A 失活或者起始处理量过量-建议：第一次试验前确保将RNase A参加了溶液P1；P1 溶液超过3 个月的，可参加一些RNase A；处理量不要过量；菌体重悬于 P1 溶液后可放置几分钟让 RNase A 充分作用后再进展下一步。