哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增.ppt

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的快速分离与基因的 PCR 扩增
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一、实验目的
#2022
二、实验原理
哺乳动物组织DNA的提取：在EDTA（鳌合二价阳离子以抑制DNase）存在的情况下，用蛋白酶K消化真核细胞或组织，用去垢剂如SDS溶解细胞膜并使蛋白质变性。核酸通过有机溶剂进行抽提纯化。污染的RNA通过RNase消化去除。根据本方法制备的哺乳动物基因组DNA约20～50 kb，适于作PCR反应的模板。～。
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术：ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ， 引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。 反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension），反应过程见图。
模板DNA在94℃条件下变性形成单链； 在55℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；72℃下在耐热性DNA聚合酶Taq 酶催化下， 在４种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。 接着又以新合成的DNA为模板进行同样反应，如次往复循环30次，由于每次循环目标DNA都以２n次幂扩增，30次循环后目的DNA的量增加106～7倍。成功的PCR反应要求反应有很好的特异性和相当的扩增效率。
要达此目的PCR反应要注意以下问题：
DNA模板：反应中DNA量在50 ng～200 ng左右。且DNA纯
度较高，以增加反应特异性。
dNTP:反应体系中达100μM～200μM。
③Mg2+：Mg2+ mM左右，浓度太低Taq
酶活力降低；太高反应特异性降低；
④引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20 nt左
右，Ｇ＋Ｃ含量在40 ％～70％之间，引物内部不能有回文
序列，引物３’端不能互补；
⑤Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性 DNA 聚合酶，
在95℃时30 min还有50％活力；
⑥变性温度：在93～95℃之间使模板充分变性。
⑦复性温度：55℃左右，此温度选择是根据模板和引物配
对结合强弱而定， 它是反应特异性的决定因素。
⑧延伸温度：70～72℃，为 Taq 酶最适反应温度。
三、实验仪器、材料与试剂
1、实验仪器与材料：
台式高速冷冻离心机，恒温水浴，真空泵，PCR仪，台式冷冻离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统，凝胶成像系统，冰箱、微量移液器、组织匀浆器，制冰机，一次性使用塑料手套和乳胶手套，猪肝组织。
2、实验试剂：
细胞裂解缓冲液 [10 mM Tris-Cl (pH ),1 mM EDTA (pH ), 1% SDS]，70% 乙醇，异丙醇，醋酸钾(pH=) [60ml的5mol/L KAc, 冰醋酸， ml H2O]，TE (pH )或无菌水，无DNase的RNase A (10mg/ml)，蛋白酶K(20 mg/mL)；
TaKaRa Taq (5U/ L)，10×PCR Buffer (Mg2+ Plus)，dNTP Mixture (each mM)，猪肝基因组DNA，引物（Forward primer and Reverse primer)。
四、实验操作步骤
（一）、猪肝组织DNA的抽提
1、切下10-20 mg 组织，在液氮中碾磨成粉末。
2、 mL 离心管中， mL 细胞裂解 缓冲液和3 μL 蛋白酶K，混匀，置于55 ℃水浴中3 h 以上,但不要超过16 h。
3、消化液降至室温，然后加入 2 μL无DNase的RNase A，混匀。37 ℃ h。
4、将样品降至室温，加入 200μL 醋酸钾溶液，剧烈震荡 20 sec 使其充分混合。冰上放置5 min。
5、12000 g 离心 5 min （4 ℃ ）。
将上清液转移到一个新离心管中， mL 异丙醇。
充分混匀， 12000 g 离心 5 min （4 ℃ ）。
去掉上清， mL 70% 乙醇。颠倒离心管数次，
12000 g 离心 1 min（4℃）。
去掉上清，空气中干燥 DNA沉淀 15 min。
将DNA沉淀溶解于 100 μL TE 或水中。
浓度和纯度测定：
OD260/OD280； 1 OD260= 50 μg/ mL
PCR扩增基因片断
94℃预变性2 min后开始以下循环
94℃ 30 sec
55℃ 30 sec 25 cycles
72℃ 30 sec
72℃ 5 min；
1、设计PCR反应程序
1
4℃ 冷却恒定。
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