DB32T3451-2018栽培稻种中杂草稻混杂检测规程.pdf

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ICS
B 22
备案号：
DB 32
江苏省地方标准
DB32/T 3451—2018



栽培稻种中杂草稻检测规程
Testing regulations of Weedy Rice in Cultivated Rice’s Seed



2018 - 09 - 06 发布 2018 - 09 - 30 实施
江苏省质量技术监督局 发布 : .
DB32/T 3451—2018
栽培稻种中杂草稻检测规程
1 范围
本标准规定了杂草稻的术语和定义、试剂配制、仪器和用具、照明要求、样品制备、操作步骤、结
果计算等方面的内容。
本标准适用于栽培稻稻种中杂草稻的检测。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 5491 粮食、油料检验扦样、分样法
GB/T 22505 粮油检验 感官检验环境照明
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。

杂草稻 weedy rice
杂草稻(weedy rice)是指在水稻田中可以自我繁衍具有杂草特性的水稻（Oryza sativa L.）物种。

纯合体的杂草稻 homozygotic weedy rice
栽培稻种子中具有红果皮的杂草稻。

杂合体的杂草稻 heterozygous weedy rice
杂草稻的花粉飘逸到栽培稻柱头上发生杂交，产生的栽培稻种子（2n = 24条染色体）中含有杂草
稻的一半染色体（n = 12条染色体），但果皮色依然表现为白色。称为杂草稻杂合体。其种植到田里开
花结果，就会产生性状分离，产生具有红色果皮的杂草稻种子。

Rc 基因 Rc gene
Rc 基因是水稻果皮原花色素积累途径中最重要的调节基因之一 ,位于第７染色体上,,
包含有8个外显子,产物为一个具有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)元件的调节蛋白。Rc基因具有比rc基因多14
bp插入/缺失，从而设计特异性14 bp插入/缺失引物进行PCR扩增，以检测杂合体杂草稻。

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DB32/T 3451—2018
4 检测前准备工作
试剂配制
聚丙烯酰胺母液（40%）：按 19:1 的比例将 38 g 丙烯酰胺和 2 g 甲叉双丙烯酰胺加入 100 ml 去离
子水中，待溶解后定容，于 4 ℃冰箱中储存备用。 5 x TBE 电泳缓冲液 1 L（母液）：54 g Tris base，
g 硼酸，20 ml EDTA（），加蒸馏水至 1L。10 %过硫酸铵：1 g 过硫酸铵溶于 10 ml 蒸
馏水中，4 ℃冰箱中保存 1 周左右。400 mL NaOH 溶液：6 g 氢氧化钠， g 四硼酸钠， ml 甲
醛 (甲醛应放入冰箱中，易变性),加蒸馏水至 400 ml，现配现用。% AgNO3：取 g AgNO3 溶解于
100ml 蒸馏水中，现配现用。
仪器和用具
稻谷检验出糙机、电动研磨机、PCR 扩增仪、电泳槽、电泳仪、照相机。
照明要求
操作过程中照明条件应符合 GB/T 22505 的要求。
样品制备
纯合体杂草稻检测取样按GB 5491-1985 执行。上述纯合体杂草稻检测后，去除红色糙米，然后将
白色糙米按 GB 5491-1985 中 的规定混匀。将样品倒在光滑平坦的桌面上或玻璃板上，用两块分样
板将样品摊成正方形，然后从样品左右两边铲起样品约10 cm 高，对准中心同时倒落，再换一个方向同
样操作(中心点不变)，如此反复混合4 次～5 次，将样品摊成等厚的正方形。取50 份，每份200 粒糙米。
5 操作步骤
纯合体杂草稻检测
使用稻谷检验出糙机脱壳，查看糙米的颜色，分别计数糙米总数（m）和红色糙米数（m1）。
杂合体杂草稻检测
磨粉
用电动研磨机将 200 粒白色糙米碾磨成粉，混合均匀，取4 份，各 30 mg。
DNA提取
采用适于提取水稻及其产品 DNA 的试剂盒方法，进行DNA 提取。制备DNA 模板时设置不加任何
试样的空白对照。
DNA溶液纯度测定和保存
将DNA 溶液适当稀释，测定并记录其在260 nm和280 nm的紫外光吸收率，OD ～
1 的区间内，OD260 nm/OD280 nm 比值应介于 ～ 之间，根据 OD260 值计算 DNA 浓度。依据
测得的浓度将 DNA 溶液稀释到 25 ng/uL，-20 ℃保存备用。
PCR反应和跑胶
见附录 A。记录杂合条带的胶孔数（n）。
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6 结果统计
纯合体杂草稻检验结果计算
纯合体杂草稻含量（M）以质量分数（%）表示，按式（1）计算：
M = （m1 / m） x 100 ……………………………………(1)
式中：
m1 ------- 糙米中红色糙米的粒数，单位为粒
m -------糙米的总粒数，单位为粒。
在重复性条件下，获得的四次独立测试结果，求其平均值，即为测试结果。测试结果保留到小数点后5
位。
杂合体杂草稻检验结果计算
杂合体杂草稻含量（N）以质量分数（%）表示，按式（2）计算：
N = ∑（n1 / 200）x 100 ……………………………………(2)
式中：
n1 -------杂合条带的胶孔数，单位为个。
在重复性条件下，获得的四次独立测试结果，求其平均值，即为测试结果。测试结果保留到小数点后5
位。
杂草稻总混杂率检验结果计算
杂草稻总混杂率（T）以质量分数（%）表示，按式（3）计算：
T = M + N ……………………………………(3)A

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BA
附 录 A
（规范性附录）
普通 PCR 方法
引物
，用TE缓冲液（） µmol/L。
表 PCR 引物序列
PCR 产物大小
检测基因 引物 引物序列 (5’-----3’)
(bp)

Primer1 RED4-For: TTACAGGGGAGCAGAAACA
Rc 118
Primer2 RED4-Rev: TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC

Primer1 RED4-For: TTACAGGGGAGCAGAAACA 104
rc
Primer2 RED4-Rev: TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC

PCR检测
PCR反应
试样PCR反应
，轻轻混匀，再加约5 μL石蜡油。10000 rpm离心10 s后，
将PCR管插入PCR仪中。反应程序为：94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性 45 s, 55℃退火 45 s, 72℃延伸l min, 30
个循环; 72℃延伸8 min。反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测或在4℃ 下保存待
用。

表 PCR 反应体系
成分 体积(μl)
2×PCR Mix
ddH2O
Primer forward (10μmol/L)
Primer reverse (10μmol/L)
模板 DNA (10-20ng/μl) 1

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注：2×PCR Mix成分为dNTP mmol L−1 、KCl 100 mmol L−1、Tris-HCl (pH ) 20 mmol L−1、
Taq Polymerase 5 U/100μL、MgCl2 mmol L−1。

对照PCR反应
在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。阴性对照是指水稻日本晴品种中
提取的DNA作为 PCR反应体系的模板；阳性对照，用杂草稻作为PCR反应体系的模板；空白对照，用无
菌水空白对照作为PCR反应体系的模板。上述各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条
。

PCR产物电泳检测
6%聚丙烯酰胺凝胶的制作
a)制作底座：在桌面上铺上报纸，用于摆放制胶用长短板，在长短板左右分别夹上两片1 mm厚薄
塑料片，用于间隔长短玻璃板，将胶灌入，用大夹子，用于固定玻璃板。按照1：100的比例配制琼脂糖
凝胶溶液，在微波炉中加热，沸腾2-3次至溶液澄清后倒入底座槽中，倒至槽子1/3处即可。将已摆放好
的长短制胶板（中间夹有薄塑料片）插入底座槽，用准备好的大夹子将其固定在制胶架上。虹吸作用会
使琼脂糖进入长短板之间，室温冷却后，即可把板子下端封闭。
b)6%聚丙烯酰胺凝胶配制：5 × TBE 5 ml, 40%丙烯酰胺 ml， ml，混匀后加入
250 ul 10%过硫酸铵和12 ul TEMED。搅拌后迅速进行灌胶。
c)灌胶：将混合液沿短板的一端慢慢灌入两板间的缝隙至上端开口处，再将胶孔梳插入两板之间，
加入少许混合液将缝隙完全灌满。注意灌胶过程中不可气泡，可以通过震荡板子将气泡赶出。
d)聚丙烯酰胺凝胶的凝固：室温下，聚丙烯酰胺凝胶经过15-20分钟将完全凝固，在此期间可以根
据液面的下降不时用剩余聚丙烯酰胺混合液补足。
e)聚丙烯酰胺凝胶板的安装：待凝胶彻底凝固后将板子拆下，放入盛有去离子水的盆中，利用水的
推力将胶孔梳取下，并剥离封口用的制胶槽和琼脂糖，在去离子水中清洗制胶板和加样孔，然后，将其
安装在加有1×TBE电泳缓冲液的电泳槽上，准备加样、电泳。
电泳
吸取2 µL的PCR产物与1 ul加样缓冲液混合后加入点样孔中，在其中一个点样孔中加入1 ul 100 bp
Marker，用于判断产物的长度。电泳时电压设置为120V，电泳时间设置为1小时。