微生物遗传结合转移省公开课一等奖全国示范课微课金奖PPT课件.pptx

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—— 三亲本杂交
微生物遗传学实验
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试验原理：1、质粒转移性
细菌遗传重组有接合转移、转化和转导三种主要方式。
接合转移是指供体和受体细胞间直接接触，质粒DNA从供体向受体转移过程。
质粒可分为可转移质粒和非转移质粒两类，转移质粒带有完整编码转移酶 tra 基因,质粒能自主地从一个细胞转移到另一个细胞,甚至还能带动供体细胞染色体 DNA 向受体细胞转移，这类质粒常被称为自主转移质粒。如大肠杆菌 F 质粒。
有些质粒不含 tra 基因,但含有质粒转移起始位点oriT，虽不能自主转移，但能被其它一些含完整 tra 基因质粒所诱动,这类质粒又被叫做可诱动质粒。
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试验原理：2、本试验所用供体质粒
本试验中要转移质粒是pHN102，它是在广宿主范围稳定载体pTR102 中插入生物发光酶基因luxAB 构建而成。
pTR102中带有含 par 基因稳定性片段（stabillty）,它能在较多革兰氏阴性细菌中稳定存在，它含有质粒转移起始位点oriT，不含完整转移基因 tra，必须在含有 tra 基因辅助菌株诱动下， pTR102 才能从供体菌向受体菌转移。
为有效筛选转移接合子
(transconjugant), pHN102
质粒上带有 Tc 抗性和生物
发光酶基因( lux AB）两个
标识。加入lux AB底物癸醛
（Decanal）后，菌体可发出
微弱荧光。
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试验原理：3、三亲本杂交
本试验中辅助菌株是E. coli (pPK2073） ， pPK2073中带完整 tra 基因，将已活化供体菌、帮助菌与受体菌混合起来，使菌体细胞紧密接触，供体菌中质粒（ pHN102 ）能够在帮助菌帮助下经过接合转移方式导入受体菌（费氏中华根瘤菌Sinorhizobium fredii ）中。所以该接合转移过程称为三亲本杂交。
试验菌株
供体菌： DH5α(pTR102-luxAB) (TcR、luxAB)
受体菌: Sinorhizobium fredii ( Tc S)
辅助菌: E. coli MM294 (pRK2073)（SpecR）
试验产物
转移接合子: S. fredii (pTR102-luxAB), (TcR，luxAB)
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试验准备
菌株活化（教师做）：
将受体、供体、辅助菌分别培养到对数期：
E. coli (pTR102-luxAB): 液体LB + Tc 20μg/ml, 37OC震荡培养1夜；
S. fredii : TY液体, 28OC震荡培养2天 ；
E. coli (pPK2073) : 液体LB + Spe 50μg/ml ,37OC震荡培养1夜
倒平板（学生做）：
第1、2组：倒不加TcSM（平皿上标识“纯SM” ）：
融化SM后，（，标识“维”)，混匀倒平板，3瓶250ml培养基共倒36－40皿。凝固后，报纸包好，放冰箱冷藏室（4OC）备用。
第3、4组：倒TY平板：
融化1瓶TY固体, 倒平板12-13个, 凝固后分发到4个超净台使用。
第5、6组：倒SM＋Tc平板（平皿上标识“SM＋Tc” ） ：
融化SM后， （Tc,10mg/ml,，标识“Tc” ），混匀倒平板，3瓶250ml培养基共倒36－40皿。凝固后，报纸包好，放冰箱冷藏室(4OC) 备用。
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操作步骤：三菌混合培养（第1天）
(1)吸收供体菌、辅助菌各 ，，（每个同学做1管），8000转/min 离心1分钟。
(2) 倒上清，向沉淀加 1ml TY液体，用 tip上下抽吸，洗涤菌体，再8000转/min离心1分钟，倒上清，留沉淀。
(3) 用镊子取灭菌滤纸片贴于已准备好TY平板上（每个同学1片，3片/平板，平皿后面标识姓名），用200μl tip 抽吸离心管内沉淀菌体，打散成浓菌液，将之加到滤纸片中央（切勿倾斜平板，以免菌液流出滤纸片以外）
(4) 加好菌液后，静置5－10分钟，待滤纸上培养基液体被平板吸收后，倒置放培养箱，28OC培养1天。
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操作步骤：洗菌涂平板（第2天）
（1）灭菌小PA瓶中加5ml无菌水(1瓶/人), 镊子揭下TY平板上滤纸片，放入瓶中，在震荡混匀器上充分打散菌体。
（2）,,混匀。
（3）吸已稀释菌液分别涂布于昨日倒 SM+Tc 平板和不加 Tc纯SM上（每个同学各涂1板， 200μl / 板）
（4）放28 OC培养6-7天，下周看结果：
在暗室内向培养皿中加10μL癸醛，3－5分钟后即可看到转移接合子luxAB基因发出微弱荧光
SM+Tc平板单菌落数
质粒转移频率＝
纯SM平板单菌落数
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