生物分析中的探针省公开课一等奖全国示范课微课金奖PPT课件.pptx

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离子探针与分子探针概述
离子探针
生命过程是一个非常复杂过程,硕士物大分子结构与功效以及生物分子转化是硕士命过程一个主要步骤。生物体中许多酶和蛋白质就是含金属离子生物功效大分子。比如：羧肽酶含Zn、磷酸脂酶含Mg、Cu和Zn、氨肽酶含Mg和Zn、钙蛋白酶含Ca、铜蓝蛋白酶含Cu。研究表明,大多数酶都要靠金属离子表现其活性,而且全部生物功效也都与金属离子相关。这种金属离子称为“生命金属”。人们能够经过研究这些生物体中金属离子来硕士物分子结构、性能和功效。
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因为生物大分子中生命金属离子如Ca(Ⅱ)、Mg(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)等,含有惰性气体电子结构。且在生物体内处于溶液状态,不成晶体,没有适宜光、磁信号,也不能够用X射线技术研究成键情况和结构改变。而过渡金属离子Cu(Ⅱ)、Fe(Ⅱ)等都有不成对d电子,有光或磁信号可供研究。假如将生物大分子中非过渡金属离子用含有光、磁信息过渡金属离子置换,用它们与生物大分子相互作用与行为来探察非过渡金属离子功效,这种技术称为“离子探针技术”。所用过渡金属离子就叫“离子探针”。
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分子探针
对于脱氧核糖核酸(DNA)片段检出、医学上基因诊疗疾病、DNA片段碱基对序列分析和蛋白质分离检出等,因为碱基和蛋白质信号很弱,又无上述生命金属,则须用信号较强分子以共价键或氢键与生物大分子连接并赋予生物大分子较强信号,以利于高灵敏度检测。这种技术称为“分子探针技术”。所用有较强信号分子称为“分子探针”。
比如：四甲基罗丹明、德克萨斯红、1-硝基-4-二甲氨基苯并恶二唑、4-甲基-7-二乙氨基香豆素、4,5-二氨基荧光素等有机物都是很好分子荧光探针(即检测信号是分子荧光)。
有机分子探针按结合方式可分为嵌入、衍生、交联和络合等。
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离子探针生物与化学依据
(1) 化学依据
从配位化学概念出发,含有惰性气体电子结构离子如Ca(Ⅱ)、Mg(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)等,与大分子配体易形成配合物。所以探针离子应与它们有相同或相同物理化学参数。如：离子电荷数、离子半径、化学配位性质、立体化学行为。Mg(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)和Co(Ⅱ)、Ca(Ⅱ)和Gd(Ⅲ)、Eu(Ⅲ)、Tb(Ⅲ)各自理化参数相同,后者可分别做前者离子探针。参数以下：
离子探针 K(Ⅰ) Tl(Ⅰ) Zn(Ⅱ) Co(Ⅱ) Mg(Ⅱ)
离子半径(nm)
静电位(Z2/r)
离子探针 Mn(Ⅱ) Ca(Ⅱ) Gd(Ⅲ) Eu(Ⅲ) Tb(Ⅲ)
离子半径(nm)
静电位(Z2/r)
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生命金属离子 易配位基团
K(Ⅰ) －O－、中性氧配位体
Mg(Ⅱ) 羧酸盐、磷酸盐、氧与氮配位体
Ca(Ⅱ) 羧酸盐、磷酸盐、多齿状氧与氮配位体
Mn(Ⅱ) 羧酸盐、磷酸盐、氧与氮配位体
Fe(Ⅱ) 氮配位体
Fe(Ⅲ) 羧酸基、酪氨酸、卟啉
Cu(Ⅱ) 胺类、硫配体
Cu(Ⅰ) 氮配位体
Zn(Ⅱ) 咪唑、半胱氨酸
Cd(Ⅱ) 半胱氨酸、巯基
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(2) 生物依据
探针离子置换原金属离子后,生物分子基本性质必须不产生改变,也就是说,置换后生物大分子基本活性能被保留,还必须含有特征信号以供检测,这就是生物依据。比如：
a) Mn(Ⅱ)取代苹果酸酶中Mg(Ⅱ)后,该酶一样含有催化L－苹果酸脱羧反应活性。
b) Co(Ⅱ)取代碳酸酐酶、羧肽酶、乳酸脱氢酶中Zn(Ⅱ),这些酶活性分别为原来酶活性50%、160%和有活性。
c) Gd(Ⅲ)、Eu(Ⅲ)或Tb(Ⅲ)取代伴刀豆球蛋白A中Ca(Ⅱ),该蛋白依然保持结合糖活性。
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离子探针基本类型
离子探针按其表示信息特征可分为紫外可见光吸收光谱探针、磁共振探针、荧光光谱探针、穆兹堡尔谱探针。
紫外可见光吸收光谱探针
利用探针离子d-d或f-f电子跃迁以及荷移跃迁吸收光谱改变和测定,判断生物分子与金属离子配位立体结构。比如：
Co(Ⅱ)取代碳酸酐酶中Zn(Ⅱ)后,由吸收光谱改变推断出该酶中Zn(Ⅱ)结合部位是一个变形四面体。X射线分析也证实了这一点。
三价稀土离子是优良Ca(Ⅱ)吸收光谱探针,尤其是Nd(Ⅲ),摩尔吸光系数最大,很灵敏。能够用其光谱研究牛血清蛋白、谷氨酸合成酶、胰蛋白酶、铜蛋白超氧化酶。之所以有较大吸收系数是因为配位体较大不对称性造成。
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磁共振探针又可分为核磁共振探针和顺磁共振探针两种。探针离子置换后,可进行NMR测定,依据化学位移、偶合常数及与傅里叶变换、二维谱、NMR成象技术结合,着重研究1H、15N、31PNMR谱,它是生物化学主要工具之一。用Tl(Ⅰ)取代生命金属K(Ⅰ),研究205TlNMR,是了解K(Ⅰ)生命功效主要方法。兔肌肉丙酮酸激活酶生命作用就是用此方法进行研究。
顺磁共振可测定金属离子中未成对电子形成磁性质和磁参数。从而可取得原金属离子共价键、配体性能、金属离子氧化还原状态、立体化学结构信息。
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荧光光谱探针又可分为有机荧光探针(即分子荧光探针)和离子荧光探针。探针离子含有荧光特征,与生物大分子结合后,其荧光特征,如：激发波长、发射波长、荧光强度、荧光寿命、荧光量子产率、各向异性等都会发生改变,从而取得生物大分子信息。当前用得最多是稀土离子深针。如[Ru(Phen)3(邻菲罗啉)]2+、[Tb(EDTA)]-。
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穆兹堡尔谱探针须采取穆兹堡尔谱仪测定。它有三个主要参数：化学位移、四极超精细分裂和兹曼(Zeeman)效应。
(1) 化学位移
它反应最邻近原子电负性和成键离子特征。这和NMR、光电子能谱等化学位移特征有类似之处。
(2) 四极超精细分裂
它主要反应了原子中电荷分布,判断极性大小和方向。
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