蛋白组学二维电泳.ppt

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浙江大学
生命科学学院
江 辉
密码：shenghua
202X
第二章 二维电泳与蛋白质分离
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一、蛋白质的提取与样品制备
二、二维等电聚焦-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳维等电聚焦电泳
三、胶上蛋白质检测技术
202X
蛋白质染色方法
胶内：考马斯亮蓝R-250 (CBB R-250)、CBB G-250、银染、负染、荧光染料染色以及放射性同位素标记等
转移到膜（PVDF、硝酸纤维素膜）上：酰胺黑(Amido Black)、丽春红S(Ponceau S)
（一）考染（考马氏亮蓝染色）
考马氏亮蓝与蛋白质反应机理
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考马氏亮蓝（Coomassie brilliant blue）是一类三苯基甲烷衍生物。分为R-250（红兰色）、R-350 （红兰色） 、G-250（蓝绿色），它们与蛋白质结合生成深蓝色复合物，在464-595nm有吸收峰（ 595nm 最大），且在比较宽的范围内（15-20 μg ）扫描峰的面积与蛋白质量成线性关系，因此可在595nm对蛋白质进行定量检测，而且在一定pH条件下，这种染料-蛋白质复合物被完全解聚。
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考染机理
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胶体内染料和溶液中自由扩散染料间形成平衡后，溶液中少量自由染料穿透凝胶基质，有选择性地对蛋白质进行染色，而胶体态的染料排阻在胶外，阻止了背景的生成。胶内蛋白质染色的关键是让蛋白质染色，而胶体不染色。
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Coommassie Brilliant Blue G-250
考染程序
考染程序至少600多种，主要变换是将以下程序中的醋酸换成三氯乙酸、磷酸或高氯酸，但三氯乙酸易使谷氨酸羧基侧链不可逆酯化，造成肽谱数据复杂化。固定：凝胶浸泡于50%乙醇+10%冰醋酸水溶液中，至少1h，可过夜。染色：凝胶浸泡于染色液中至少2h。染色液组成：45%甲醇+10%冰醋酸+%考马氏亮蓝G-250，混均过滤。脱色：多次更换脱色液，直至背景脱净，稍稍提高温度可加快脱色。脱色液组成：25%乙醇+8%冰醋酸。保存：凝胶脱色后水洗扫描备份，用保鲜膜包裹，一个月内进行质谱鉴定；长时间保存需将蛋白点切下，进一步脱色后贮于-80 ℃。
4、考染特点
可以获得无背景或低背景的图谱；染色过程需24-48h，所需时间较长；灵敏度不高，为100-10ng，只能检测10- 100ng 的蛋白质，低丰度的蛋白质难以显色。
（二）银染
原理：
碱性银氨（Ag(NH3)2+）染色法和酸性硝酸银（AgNO3）染色法。
酸性硝酸银染色法的原理是一个照相的过程，凝胶在酸性环境下与硝酸银温育，银离子附与蛋白质表面，然后在碱性环境下里用福尔马林还原成金属银。
碱性银氨染色法的原理是用氨水来形成银氨复合物，银氨复合物与胶内SDS-蛋白质复合物结合，然后在酸性条件下用福尔马林将银氨还原成金属银。
酸性银染染色背景浅、容易控制，对酸性蛋白质的染色灵敏度稍高；碱性银染灵敏度稍高，但背景深、不容易控制。相对于考染，灵敏度高，可达200pg。但由于存在戊二醛的特异性反应，对下一步的酶切肽谱提取存在困难；增敏过程蛋白质被部分提取至胶外。
特点
1. 分析型银染（碱性银氨法，不能用于质谱鉴定）(1) 水洗胶5 min；(2) 40%乙醇，10%乙酸固定1 hr；(3) 5%乙醇，5%乙酸固定过夜；(4) 水洗20 min两遍；(5) 5%戊二醛 1 h；(6) 水洗30 min，四遍；(7) 250mL新鲜配制的银氨液(1mL NaOH 与5mL 饱和氨水混合再加10mL 20%AgNO3)/胶45 min；(8) 水洗3 min，三遍；(9) mL 1%柠檬酸、125μL 37%甲醛/胶显色；(10) 5%乙酸停显10min；(11) 水洗10 min三遍。
3、程序