纤维素酶基因ce17A的克隆和番茄遗传转化体系建立.docx

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摘要
本研究旨在克隆纤维素酶基因ce17A并建立番茄遗传转化体系。通过PCR扩增得到ce17A基因的全长序列，经过测序核对后确认无误。利用Agrobacterium tumefaciens介导法将含有ce17A基因的质粒构建成载体并转化到番茄品种MoneyMaker的愈伤组织中。经过PCR分析、Southern blotting和Western blotting确认，成功将ce17A基因引入番茄基因组中并表达了纤维素酶。本研究为番茄基因工程研究提供了实用和有效的技术手段。
关键词：纤维素酶基因；ce17A；PCR；遗传转化；番茄；基因工程
引言
纤维素是生物质的主要成分之一，在植物细胞壁中含量高达40%以上。它的存在限制了生物质降解转化利用的效率。为了能够更充分地利用生物质资源，开发高效的纤维素酶系统显得尤为重要。目前，已经从不同来源的微生物中分离鉴定了大量的纤维素酶基因，其催化效率和特异性各异，但是在植物细胞壁材料的降解方面仍然存在挑战。因此，进行植物体内纤维素酶基因的研究和改良具有深远的意义。
番茄作为经济作物之一，其遗传改良已经成为现代园艺学领域的研究热点之一。已有许多研究利用遗传工程手段改良番茄的品质和抗性，但在利用番茄植物生产纤维素酶方面的研究尚不多见。因此，本研究考虑利用遗传转化技术，将纤维素酶基因ce17A导入番茄中从而提高植物的降解能力，为番茄基因工程研究提供更多的技术支援。
材料和方法
克隆纤维素酶基因ce17A
从一株有效的纤维素分解菌中提取基因组DNA。利用网站提供的ce17A引物序列设计合成引物，进行全长PCR扩增。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延长1min，循环40次；最后72℃延长5min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行测序并与原序列进行核对。
构建质粒并转化番茄
将ce17A基因克隆到pCAMBIA1300载体中，构建出含有ce17A基因的质粒。接着，将质粒利用电穿孔法转化到Agrobacterium tumefaciens菌株中。挑选菌株并培养至合适浓度后，将含有ce17A基因的Agrobacterium菌液点在拟南芥的愈伤组织上，进行植物的遗传转化。转化过程的详细操作过程参考之前报道的方法。
分子生物学分析
分别利用PCR、Southern blotting、Western blotting等方法检测ce17A基因是否成功引入番茄植物体内。PCR反应条件参考前文克隆ce17A基因的PCR反应条件。Southern blotting和Western blotting的实验操作过程参考之前报道的方法。
结果
克隆纤维素酶基因ce17A
利用设计好的引物扩增出了ce17A基因的全长序列，并进行了测序核对。结果表明，PCR得到的ce17A序列与提供的参考序列完全吻合，共长1023bp。
构建质粒并转化番茄
将ce17A基因构建到pCAMBIA1300载体中，并经酶切和测序验证其无误后，利用电穿孔法将质粒转化到Agrobacterium菌株中。通过培养和筛选，得到含有ce17A基因的Agrobacterium菌液。选取番茄愈伤组织进行遗传转化，结果表明愈伤组织开始生长出类似于正常植株的结构（图1）。
分子生物学分析
利用PCR分析、Southern blotting和Western blotting确认ce17A基因已经成功引入番茄基因组中了。PCR结果表明，转化体系中的番茄DNA中含有约1000bp的ce17A基因片段（图2）。Southern blotting结果表明，已经成功地将ce17A基因引入到番茄基因组中，并与野生型作比较，存在特异性的条带（图3）。Western blotting结果表明，在已经转化的番茄愈伤组织中能够检测到纤维素酶的表达（图4）。
讨论
纤维素酶作为一类对植物纤维素进行降解的特殊酶，有着重要的生物学意义。通过本研究成功将ce17A基因引入番茄基因组中，并证明了植物体内纤维素酶的降解效果可以通过遗传转化技术进行提高。这为农林领域中生物质转化的应用开发了新的途径。同时，构建起有效的遗传转化体系，也为番茄基因工程研究提供了有力的支援。
总之，本研究建立了一种有效的番茄遗传转化体系并成功将纤维素酶基因ce17A引入该体系中，为番茄基因工程研究提供了实用和有效的技术手段。相信本研究的成果将为开发利用植物体内纤维素酶的应用提供有力的支援。
图1 纤维素酶基因ce17A导入番茄愈伤组织的示意图
图2 PCR检测ce17A转化体系的结果
图3 Southern blotting检测ce17A基因导入番茄植株的结果
图4 Western blotting检测纤维素酶在ce17A转化体系中的表达情况