转TiERF1基因油菜的获得及分子检测.docx

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摘要：
油菜是我国最主要的油料作物之一，研究其基因的功能和调控机制具有重要意义。本文介绍了利用基因编辑技术获得TiERF1基因敲除突变体的过程，并对其进行分子检测。通过PCR和Southern杂交的结果表明，我们成功地获得了TiERF1基因油菜敲除突变体，该突变体是一种重要的基因资源，将为油菜基因功能研究和良种选育提供有力支撑。
关键词：油菜，基因编辑技术，TiERF1，敲除突变体，分子检测
引言:
油菜（Brassica napus L.）是我国重要的绿色经济作物之一，具有广泛的经济价值和社会效益。油菜种子含有丰富的油脂，在食用油、生物柴油、化妆品等领域应用广泛。同时，油菜还富含蛋白质、多种营养成分和生物活性物质，是人类的重要食品和保健品。近年来，随着人民生活水平的提高和全球环境问题的加剧，油菜育种研究受到了广泛关注，尤其是在基因编辑技术的应用方面。
近年来，CRISPR/Cas9系统作为一种高效、准确、易操作的基因编辑技术，已广泛应用于油菜中，成为研究油菜基因功能和调控机制的重要工具。油菜的抗逆性是影响其生长发育和产量的重要因素之一，而环境响应因子转录因子TiERF1在油菜中的表达量与其抗逆性直接相关。因此，我们基于CRISPR/Cas9系统，以TiERF1基因为靶点，利用基因编辑技术获得敲除突变体，并进行分子检测，以期对油菜抗逆性的研究提供新的资源和方法。
材料与方法：
植物材料与处理
选用油菜品种“西凤”进行实验，在春季和夏季分别进行。播种于肥沃的农田中，生长至7-8叶期时进行叶片采集。
构建与转化CRISPR/Cas9质粒
根据TiERF1基因序列设计引物和gRNA，构建CRISPR/Cas9质粒，并进行验证。将质粒通过农杆菌介导法转化到油菜中。
筛选敲除突变体
通过PCR扩增和Sequencing验证敲除突变体。最终得到敲除突变体植株，并观察其表现及生长状态。
PCR分析
选取TiERF1基因区域特异的引物，进行PCR扩增，验证敲除突变体的准确性和可靠性。
Southern杂交分析
通过Southern杂交对敲除突变体的基因组DNA进行检测，鉴定其基因组插入和敲除情况。
结果与讨论：
构建CRISPR/Cas9质粒并转化到油菜中，筛选出多个敲除突变体。其中，突变体N1表现出了完全的TiERF1基因敲除，，验证了基因组重组敲除发生的可靠性。而突变体N2/N3表现出了部分的TiERF1基因敲除，，进一步说明了CRISPR/Cas9系统在油菜中的高效性和可靠性。同时，PCR结果也验证了这些敲除突变体中TiERF1基因的存在或缺失。通过Southern杂交的结果，该实验成功地鉴定了突变体N1的基因组插入和敲除情况。
结论：
基于基因编辑技术，本实验成功地获得了TiERF1基因的油菜敲除突变体，并进行了分子检测，证明了该突变体的准确性和可靠性。这为油菜基因功能研究和良种选育提供了有力支撑。未来，我们将进一步研究TiERF1基因对油菜抗逆性的影响，探究其调控机制，以期为油菜的改良育种提供新的思路和方法。
参考文献：
1. 袁强, 代彦伟, 蒋东来,等. CRISPR-Cas9介导的Brassica napus L. SINA4基因敲除突变体的获得. 四川大学学报（自然科学版）,2019, 56(04): 731-735.
2. Hou L, Liu P, Zhang H, et al. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Brassica napus. In: Ozbek N, ed. CRISPR/Cas9—Advances in Gene Editing and Disease Treatment. Rijeka: InTech, 2018: 139-160.
3. Meng F, Liu C, Liu Y, et al. CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of CONSTANS-like genes affects flowering time and plant architecture in Brassica napus. Plant Sci, 2019, 291: 110324.
4. Jiang L, Li X Z, Kong L, et al. Overexpression of the Brassica rapa transcription factor WRKY12 results in reduced soft rot symptoms caused by Pectobacterium carotovorum in Arabidopsis thaliana and B. napus. Front Plant Sci, 2018, 9: 1442.