免疫组化标准操作规程.doc

石蜡切片免疫组化二步法操作规程
基于DAKO Real Envision Detection Kit
65℃烤箱中烤片30min;
二甲苯脱蜡(共四缸,第一缸10min,后三缸涮过);
梯度酒精脱苯(100%两缸,90%、80%、70%各一缸,依次涮过);
自来水振洗;
去离子水浸洗1次;
抗原修复;
PBS振洗三次;
3%过氧化氢-甲醇溶液室温孵育30min;
PBS振洗三次;
一抗4℃孵育过夜;
PBS振洗三次;
滴加二抗聚合物,室温孵育30min;
PBS振洗三次;
滴加DAB,显微镜下控制显色,去离子水终止显色,记录显色时间;
自来水冲洗一次;
苏木素复染30sec;
自来水清洗一次;
盐酸酒精分化5sec;
自来水冲洗30min返蓝;
梯度酒精脱水(70%、80%、90%各一缸,100%两缸,依次涮过);
二甲苯脱水(共三缸,前两缸涮过,第三缸5min);
中性树胶封片。
石蜡切片免疫组化三步法操作规程
基于DAKO LSAB2 System-HRP Detection Kit
65℃烤箱中烤片30min;
二甲苯脱蜡(共四缸,第一缸10min,后三缸涮过);
梯度酒精脱苯(100%两缸,90%、80%、70%各一缸,依次涮过);
自来水振洗;
去离子水浸洗1次;
抗原修复;
PBS振洗三次;
3%过氧化氢-甲醇溶液室温孵育30min;
PBS振洗三次;
切片置于湿盒中,滴加封闭血清(白色滴瓶装)室温封闭孵育30min;
甩去封闭血清(无需PBS清洗),滴加一抗4℃孵育过夜;
PBS振洗三次;
滴加二抗(黄色滴瓶装),室温孵育30min;
PBS振洗三次;
滴加HRP试剂(粉色滴瓶装),室温孵育30min;
PBS振洗三次;
滴加DAB,显微镜下控制显色,去离子水终止显色,记录显色时间;
自来水冲洗一次;
苏木素复染30sec;
自来水清洗一次;
盐酸酒精分化5sec;
自来水冲洗30min返蓝;
梯度酒精脱水(70%、80%、90%各一缸,100%两缸,依次涮过);
二甲苯脱水(共三缸,前两缸涮过,第三缸5min);
中性树胶封片。
抗原修复
(1)抗原修复液:
1):商品化储存液,1:100稀释,200ml/框;
2) Tris-EDTA缓冲液:商品化储存液,1:50稀释,200ml/框;
3) Tris-EDTA缓冲液:商品化储存液,1:50稀释,200ml/框;
4)胰酶(Trypsin)修复液:商品化储存液,1:5稀释。
(2)抗原修复法
高压修复:电压力锅设定121℃,5min,将切片置于抗原修复缓冲液中