蛋白质分离、提取.ppt

综合性实验蛋白质的分离提取、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western印迹
蛋白质的分离提取
蛋白质分子在水溶液中因其表面带有一定数量的电荷及形成水化膜使其成为稳定的胶体颗粒。在某些物理或化学因素影响下,蛋白质颗粒由于失去电荷和水化膜而沉淀。
中性盐、重金属盐、三氯乙酸和乙醇等都是常用的沉淀蛋白质的试剂。
Ⅰ、蛋白质的盐析
大量中性盐类如硫酸铵(NH4)2SO4、硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)等加入到蛋白质溶液后,可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。
各种蛋白质分子的颗粒大小和电荷数量不同,用不同浓度中性盐可使各种蛋白质分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白便沉淀下来。盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性,加水稀释降低盐浓度,能使沉淀的蛋白质重新溶解,并保持其生物活性。因此,利用盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。
Ⅱ、重金属盐和三氯乙酸沉淀蛋白质
重金属离子如Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag+等可与蛋白质分子上的羧基结合生成不溶性蛋白质金属盐而沉淀。三氯乙酸属生物碱试剂,能与蛋白质分子上的氨基结合而沉淀。它们均可引起蛋白质分子的变性和失去生物学活性。
Pr
NH3+
COO-
OH-
Pr
NH2
COO-
Ag+
Pr
NH2
COOAg
Pr
NH3+
COO-
CCl3COOH
Pr
NH3+·-l3
COOH
Ⅲ、乙醇沉淀蛋白质
某些可与水混合的有机溶剂如甲醇、乙醇和丙酮等,能破坏蛋白质的水化膜,降低其在溶液中的稳定性。当加入少量中性盐如NaCl等或溶液pH接近等电点时,蛋白质胶粒上的电荷被中和,加入上述有机溶剂可使蛋白质沉淀。反应在0℃~4℃下进行,并应立即分离沉淀物,否则蛋白质会变性。
带电荷的质点,在一定条件的电场作用下,可向一极移动,如带正电荷的质点移向负极,这种现象称为电泳。许多生物分子都带有电荷,其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。蛋白质是两性电解质,可带正电荷也可带负电荷。大部分蛋白质的PI﹤6,在PH ,在电场中向正极移动。移动的速度主要决定于带电荷的多少和分子的大小。电荷多、分子小,移动就快;反之就慢。
影响电泳的主要因素

当介质的pH等于某种两性物质的等电点时,该物质处于等电状态,即不向正极或负极移动。当介质pH小于其等电点时,则呈正离子状态,移向负极;反之,介质pH大于其等电点时,则呈负离子状态,移向正极。因此,任何一种两性物质的混合物电泳均受介质pH的影响,即决定两性物质的带电状态及电量。

离子强度对电泳的影响是:离子强度低,电泳速度快,区带分离不清晰;离子强度高,电泳速度慢,但区分带分离清晰。如离子强度过低,缓冲液冲量小,不易维持pH的恒定;离子强度过高,则降低蛋白质的带电量(压缩双电层),使电泳速度减慢。~。

电场强度和电泳速度成正比关系。电场强度以每厘米的电势差计算,也称电势梯度。如纸电泳的滤纸长15cm,两端电压(电势差)为150V,则电场强度为150/15=10 V/cm。电场强度愈高,则带电粒子的移动愈快。电压增加,相应电流也增大,电流过大时易产生热效应,可使蛋白质变性而不能分离。

在电场中,液体对固体的相对移动,称为电渗。如滤纸中含有表面带负电荷的羧基,溶液则向负极移动。由于电渗现象与电泳同时存在,所以电泳的粒子移动距离也受电渗影响。如纸上电泳蛋白质移动的方向与电渗现象相反,则实际上蛋白质泳动的距离,等于电泳移动距离减去电渗距离。