波浪力学第二章 小振幅波理论.doc

细胞培养用液的配制与消毒
一、器材与试剂:
干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。
具体步骤:
(1)水的制备:
细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.
(2)PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS,如:Hanks,D-Hanks液的配制):
:将药品(NaCl ,KCl ,Na2HPO4·H2O ,KH2PO4 0. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液。
:将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
(3) 胰蛋白酶溶液的配制与消毒:
   胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,、温度为37℃时,胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如:D-Hanks液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
:%,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水()或PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀,置于4℃内过夜。
:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器()抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
(4)青、链霉素溶液的配制于消毒
(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。
。青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。
,使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位=1微克
(5)RPMI1640的制备与消毒:
、调PH值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。。最后定容至1000ml,摇匀。
:安装时先装好支架,按规定放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。
(4℃时两周有效)。
(6)血清的灭活:
细胞培养常用的是小牛血清,新买来的血清要在56℃水浴中灭活30分钟后,再经过抽滤方可加入培养基中使用。
(7)HEPES溶液:
HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L,一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。
1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下:
准确称取HEPTS ,加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌,分装后4℃保存。
注意:因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶,所以可根据实际情况灵活配制,但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如:,过滤除菌后可完全(20ml)加入1L培养液中,或者每100ml培养液中加入2ml即可。
(8)谷氨酰胺:
合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4℃下放置1周可分解50%,故应单独配制,置于-20℃冰箱中保存,用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时,应重新加入原来的谷氨酰胺。
一般培养液中谷氨酰胺的含量为1~4