实验三 对流免疫电泳.ppt

实验三对流免疫电泳
【实验目的】
掌握对流免疫电泳的原理、操作方法、
结果判定及了解其用途。
【实验原理】
带电胶体颗粒可在电场中定向移动,移动速度及
方向与颗粒所带电荷及分子量大小有关。蛋白质
为两性电解质,每种蛋白质都有自己的等电点,
在pH值大于其等电点的溶液中,羧基解离多,蛋
白质带负电,向正极泳动;在pH值小于其等电点
的溶液中,氨基解离多,蛋白质带正电,向负极
泳动。pH值离等电点越远,所带电荷越多,泳动
速度也越快。因此,可通过控制溶液的pH值的方
法,使抗原抗体在通电的琼脂板上泳动,进行抗
原抗体成分的分析,或进行抗原抗体的检测。
,在这种溶液中:
抗原分子羧基解离带负电荷,且分子量小,泳动速度快,能克服琼脂中的电渗阻力,故在电泳时从负极向正极移动。
抗体属球蛋白,所暴露的极性基团较少,在碱性缓冲液电离也少,只带微弱的负电荷,且相对分子质量较大,电泳力较小,泳动速度慢,克服不了电渗阻力,在琼脂电渗力作用下反而由正极向负极移动。
将抗体置正极端,抗原置负极端,则电泳时抗原抗体相向泳动,在两孔之间相遇,在比例最合适处就会形成白色沉淀线。
免疫电泳的特点:
免疫电泳是由琼脂扩散与电泳结合而成的一种检测技术。抗原抗体在凝胶中扩散的同时,加入电场力的作用,使抗体或抗原在凝胶中的扩散移动速度加快,缩短了试验时间;同时限制了扩散移动的方向,使集中朝电泳的方向扩散移动,增加了试验的敏感性,所以该方法比一般的凝胶扩散试验更快速和灵敏。
【实验材料】
1、∕。
2、抗体羊抗人的IgG血清。
3、抗原人的IgG。
4、1%, 冰箱保存备用。
5、仪器电泳仪、电泳槽
6、器械载玻片、打孔器、10ml吸管、
移液器、移液头。
【实验方法】
1、%琼脂板制备
①
中,加入1g琼脂粉,加热至完全溶解,冰箱保
存备用。
②%琼脂,待冷却至50~60℃时,
用10mL吸管吸取6mL加于载玻片上。
2、打孔在凝固后的琼脂板上,用打孔器打两排
孔,孔间距为4mm。
Ab
Ag
Ab
Ag
标记孔
沉淀线
3、加样将抗原加入琼脂板上有标记孔侧的
小孔中,抗体加入另一侧小孔中,
以加满为度,不可溢出孔外。
4、电泳将加好样品的琼脂板置电泳槽上,
抗原侧置负极端,抗体孔侧置正极
端。搭好桥后,接通电源,控制电
压6~10 V/cm板长,电泳约30~60
min。
5、关闭电源,取出琼脂板,观察结果。