蛋白裂解液.doc

蛋白质的定位与蛋白质裂解液的选择:
全细胞:NP-40或RIPA
细胞质(可溶):Tris-HCl
细胞质(细胞骨架):Tris-Triton
细胞膜:NP-40或RIPA
细胞核:RIPA
线粒体:RIPA
RIPA裂解液配方
1ml RIPA buffer contains 35μl proteinase inhibitor and 10μl phosphatase inhibitor
RIPA buffer
最终浓度
1M Tris-HCl ()
5 ml
50mM
NaCl

M
Na-deoxycholale

(%)
EDTA()

NaF
41 mg
Nonidet P40
1 ml
(1%)
Aprotinin10μg/μl
100μl
10μg/ml
加水到 100ml
Aprotinin 10μg/μl ;用10mM HEPES-KOH()溶解,备用。
Nonidet P-40简称NP-40,乙基苯基聚乙二醇,常用非离子性去垢剂。
Na-deoxycholale,脱氧胆酸钠,离子型去垢剂。离子型去垢剂主要作用有:裂解细胞;溶解蛋白,尤其是可以溶解一些难溶于水的蛋白,如膜蛋白等;很适合做WB,但在Co-IP中使用,需要谨慎。
亮抑霉肽(Leupeptin):抑制丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、纤溶酶、猪胰激肽原酶)和半胱氨酸蛋白酶(包括木瓜蛋白酶和组织蛋白酶B)
抑肽素A(Pepstatin A)抑制各种天门冬氨酸蛋白酶,例如组织蛋白酶D、肾素、胃蛋白酶、细菌天门冬氨酸蛋白酶和HIV蛋白酶;
胰凝乳蛋白酶抑制剂(Chymostatin)抑制具有糜蛋白酶类特异性丝氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶、胃促胰酶、组织蛋白酶 G)和大多数丝氨酸蛋白酶(包括组织蛋白酶B,H,L)
抗木瓜蛋白酶(Antipain)抑制木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和纤溶酶。
氟化钠抑制酸性磷酸酶
正钒酸钠:抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶(tyrosine phosphatase)
焦磷酸钠(sodium pyrophosphate):抑制丝氨酸-苏氨酸磷酸酶(serine-threonine phosphatase) 。
在与蛋白相关的检测中,首先最关键的一步便是蛋白质的提取。蛋白质的提取过程中,我们要经常加和蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。另外在磷酸化蛋白的研究过程中,磷酸酶抑制剂也是必不可少的,本文总结了常用的蛋白酶抑制剂PMSF,Leupeptin 亮肽素,Aprotinin抑肽酶,Pepstatin胃蛋白酶抑制剂,EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制剂NaF氟化钠,Na3VO4 原矾酸钠,BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠,Na2P2O4 焦磷酸钠等。对这些蛋白酶抑制剂的溶解配制,贮存液与工作液浓度,保存都做了详细的说明。
蛋白酶抑制剂
PMSF:
特性:丝氨酸蛋白酶抑制剂,如胰凝乳蛋白酶,胰蛋白酶和凝血酶,也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶(可逆的地面处理)。
溶解性:溶于异丙醇,乙醇,甲醇和丙二醇果>10mg/ml。在水溶液中不稳定。在100%异丙醇, +25℃时稳定至少9个月
分子量: