环境工程微生物.doc

环境工程微生物
实验指导书
《环境工程微生物》教研组编
环境与资源学院环境工程实验教学中心
二 00 四年三月
实验一细菌革兰氏染色法
一、目的要求
1. 学习并初步掌握革兰氏染色技术;
2. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、基本原理
革兰氏染色法是 1884年由丹麦病理学家 。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G )和革兰氏阴性菌(G )两大类,是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为 G 菌和 G - 菌,是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G -菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色。革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征,为保证染色结果的正确性,采用规范的染色方法是十分必要的。本实验将介绍被普遍采用的 Hucker 氏改良的革兰氏辩色法。
三、实验材料
:培养12-16h的枯草杆菌(Bacillus subtilis),培养 24小时的大肠
杆菌(Escherichia coli)。
:结晶紫染液、卢哥氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液、番红染液等。
:显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯、废液缸、洗瓶。
四、实验方法与步骤
(一)制片取菌液按常规技术进行涂菌、干燥、固定。
(二)染色
:在制片上滴加适量(以盖满细菌涂面)结晶紫染液,染 l min后,用水洗去染料。
:滴加卢哥氏碘液 l min 后,水洗。
:将玻片倾斜,在白色背景衬托下,用滴管滴加95%乙醇脱色,摇
动玻片直至流出的乙醇无紫色时(根据涂片之厚薄需时 30s-60s) ,立即水洗。
:滴加番染液约 3-5min,水洗。
:将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。
:镜检时先用低倍,再用高倍,最后用油镜观察,并判断菌体的革兰氏染色反应性,绘图。
:按上述方法,在同一载玻片上,以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的做混合器涂片,染色、镜检,进行比较,绘图。
:用以上方法对未知菌进行革兰氏染色,并绘图、记录染色结果。
。
注意:
,切忌过厚,否则易出现脱色不完全而引起的假阳性。
。如脱色过度,革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌;如脱色时间过短,革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响,难以严格规定。
。用水冲洗后,应吸去玻片上的残水,以免染色液被稀释而影响染色效果。
。G+菌培养12h-16h,E. coli培养 24h。若菌龄太老,由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
五、实验报告
记录革兰氏染色法步骤、未知菌的检测结果,并进行结果分析。
六、思考题
、金黄色葡萄球菌的革兰氏染色视野图。
,请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株,以证明你的染色结果的正确性?
?若不正确,请说明原因。
。
?其中最关键的环节是什么?
实验二水体中粪便污染指示菌的检测-多管发酵法
一、目的要求
1. 学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。
2. 了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。
二、实验原理
水中的病菌如伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、钩端螺旋体等主要来自人和动物的粪便及污染物。因此,粪便管理在控制和消灭消化道传染病有重要意义。由于肠道病原菌在水中数量较少,故直接检查水中的病原菌是比较困难。大肠菌群细菌是肠道好氧菌中最普遍和数量最多的一类细菌,所以常常将其作为粪便污染的指示菌。即根据水中大肠菌群细菌的数目来判断水源的污染程度,并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。目前我国规定生活饮用水的标准为1mL水中细菌总数不超过 100个;每升水中大肠菌群数不超过 3个。超过此数,表示水源可能受粪便等污染严重,水中可能有病原菌存在。大肠菌群细菌是指一类好氧或兼性厌氧,能发酵乳糖,在乳糖培养基中经 3