实验六硫化氢(H2S)含量的测定.ppt

实验六硫化氢(H2S)含量的测定(第六组:杨如春、农春响、李太蓉、陈登卫、何再炳)
I 二六硝基苯甲酸法

硫化氢(H2S)目前被认为是植物中一种新的信号分子,参与植物细胞的氧化还原平衡等多种生理过程。H2S易溶于水,1molH2S与1mol二六硝基苯甲酸(DT-NB)反应后,形成2mol黄色产物——硫硝基苯甲酸,此物质在412nm处有最高吸收峰,并且在此波长处的毫摩尔吸光系数为£412=--1,因此可根据硫硝基苯甲酸生成的量来计算植物组织中H2S的含量。实验中常用的H2S供体有NaHS、Na2S、GYY4137等,它们溶于水后可释放出H2S,H2S在水中溶液中常解离为H+、HS-、S2-。
、仪器设备及试剂
(1)材料取热激0h、热激4h并恢复4h和高温胁迫17h的玉米幼苗。
(2)仪器设备紫外可见分光光度器,高速冷冻离心机,微量加样器,分析天平,水浴锅,研钵,量筒,吸量管,刻度试管,试管架,容量瓶,药勺。
(3)试剂 H2S提取液(100mmol/L磷酸钾缓冲溶液(),内含10mmol/%醋酸锌);50 mmol/L FeCl3( mol/L HCl配置);5mmol/LN,N-二甲基对苯二胺(
HCl配置);10μmol/LNa2S。

(1)H2S的提取
热激0h(热激前)黄化玉米幼苗
热激4h并恢复4h黄化玉米幼苗
48℃高温胁迫17h黄化玉米幼苗



加预冷的提取液1mL和少许石英砂,充分冰浴研磨
转入离心管离心15min(4℃下12000×g),取上清液
(2) H2S的测定
取200µL上清液
加入提取液3760µL,摇匀
再加40µL20mmol/L DTNB ,摇匀2min
于412nm处测定吸光度A412
(3)标准曲线的制作
10μmol/L
NaHS(mL)
0
2
4
6
8
10
蒸馏水(mL)
10
8
6
4
2
0
各取1mL于6支试管中
分别去200µL,加入提取液3760µL,摇匀
再加入40µL20mmol/L DTNB ,再摇匀2min
于412nm处测定吸光度A412
以NaHS浓度为横坐标,A412为纵坐标,建立标准曲线或回归方程

从标准曲线中查找出相应的H2S浓度,用µmol/g表示H2S含量。
H2S含量(µmol/g)=C/w×(Vt/1000)
式中:C为标准曲线上查出的H2S浓度;
Vt为提取液的总体积,即1mL;
W为材料的鲜重(g)。

(1)离心后上清液应定容到一个准确的体积,以便于含量计算。
(2)实验中,应严格控制DTNB的用量。
Ⅱ亚甲蓝法

在FeCl3(作为氧化剂)存在的强酸性条件下,硫化氢(H2S)与N,N-二甲基对苯二胺反应生成蓝色的亚甲蓝,亚甲蓝在667nm处有最大吸收,故可根据亚甲蓝生成的量来计算植物组织中H2S的含量。此法专一性和灵敏性好,检测极限低于 5μmol/L,理想条件下可达到 10 nmol/L。
、仪器设备及试剂
(1)材料取热激0h、热激4h并恢复4h和高温胁迫17h的玉米幼苗。
(2)仪器设备紫外可见分光光度器,高速冷冻离心机,微量加样器,分析天平,水浴锅,研钵,量筒,吸量管,刻度试管,试管架,容量瓶,药勺。
(3)试剂 H2S提取液(100mmol/L磷酸钾缓冲溶液(),内含10mmol/%醋酸锌);50 mmol/L FeCl3( mol/L HCl配置);5mmol/LN,N-二甲基对苯二胺(
HCl配置);10μmol/LNa2S。

(1)H2S的提取
热激0h(热激前)黄化玉米幼苗
热激4h并恢复4h黄化玉米幼苗
48℃高温胁迫17h黄化玉米幼苗
1g
1g
1g
加预冷的提取液3mL和少许石英砂,充分冰浴研磨
转入离心管离心15min(4℃下12000×g),取上清液