遗传学实验八-果蝇基因组DNA提取.ppt

《遗传学实验》
深圳大学生命科学学院实验楼205
实验八、果蝇基因组DNA的提取
一、实验目的
通过实验掌握动物基因组DNA抽提的操作过程,了解DNA提取的意义。
预备知识
核酸是重要的生物大分子之一,脱氧核糖核酸(DNA)是核酸的一种,DNA是绝大多数生物(除少数RNA病毒外)记录、存储、传递遗传信息的分子。近年来,分子生物学技术迅速发展,在分子遗传学研究领域的诸多方面涉及到抽提基因组DNA的方法。DNA的提取是进行PCR扩增、Southern杂交、限制性片段长度多态性分析等实验的基础。
二、实验原理
使用消化缓冲液使DNA从细胞内释放出来,65度温育可以加速DNA溶解,酚——氯仿异戊醇抽提可以将蛋白质与DNA分离,冷的异丙醇沉淀DNA,70%的乙醇洗去DNA表面的残留有机溶剂。
三、实验材料
新鲜存活的果蝇或-20℃冻存1h的果蝇个体5~10个。
四、实验仪器及用具
器具:玻璃棒、烧杯、离心管、量筒、分析天平、水浴锅、台式高速离心机、4℃冰箱、长玻璃吸管、微量加样器、枪头、紫外分析仪、琼脂糖电泳装置。
五、药品和试剂
酚(Tris饱和酚)、氯仿、异戊醇、十二烷基硫酸钠(SDS)、Tris 碱、乙二胺四乙酸(EDTA)、异丙醇。
溶液配制:
消化缓冲液:含100mM的Nacl,10mM (), 25mM的EDTA(), %的SDS。
TE缓冲液():含10mM (),1mM的EDTA()。
电泳缓冲液TAE:
电泳缓冲液(50×TAE): ,冰醋酸 , EDTA ()20ml ,加蒸馏水至 100ml。1×TAE 为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。
%琼脂糖凝胶的配制:,加入40ml 1×TAE,于电炉上加热至沸腾,待凝胶冷却至50℃左右(手试微烫),加入3μl GoldViewTW荧光染料,混匀后将胶倒入插好梳子的制胶板上,冷却后备用。
六、实验步骤
1)取6只麻醉的果蝇(让乙醚挥发干净),加入消化缓冲液30μl,用200μl Tip枪头迅速捣碎。
2)补加消化缓冲液400μl,混匀,置65℃温浴30分钟每10分钟摇荡一次,以使样品被充分消化。
3)取出离心管加入400μl酚,400μl氯仿:异戊醇(24:1)的混合物,盖紧管盖,上下颠倒充分混匀,抽提样品5min,12000rpm离心5分钟。
4)小心吸取上清转移至新的离心管中。加入400μl异丙醇,轻轻混匀3min,此时可见白色线团状物质出现。
5)14000rpm离心10分钟,让线团状物质沉到管底或管壁,小心倒出液体。
6)用400μl 70%的乙醇洗涤沉淀,12000rpm离心5min,倒掉乙醇,倒置晾干至乙醇味道消失,沉淀用50μl TE 缓冲液溶解。
7)取5-8μl DNA溶液,与2μl上样buffer混合,%的琼脂糖凝胶上,120伏电压下电泳30min。
8)将琼脂糖凝胶置于紫外分析仪中观察DNA条带的绿色荧光。
注意事项:
A 实验前将部分药品(酚、氯仿、异戊
醇、异丙醇)4℃预冷。
B 消化液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进
DNA溶解C 避免在操作过程中机械振动过于剧烈,以免
造成DNA的断裂。
D 使用离心机要注意安全,先定时,再将转速
从零慢慢增大。
E 乙醇洗涤DNA后一定要晾干,否则电泳点
样时样品容易上漂。
基因组DNA的提取图片