脯氨酸含量测定.doc

逆境胁迫下植物体脯氨酸含量测定
【实验目的】
了解脯氨酸在植物抗逆性决定中的作用。
掌握脯氨酸提取和测定的方法。
【实验原理】
逆境条件下(干旱、盐碱、热、冷害、冻害),植物体内脯氨酸含量会显著增加,并且积累指数与植物的抗逆性有关,因此脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。
测定脯氨酸含量目前一般使用的方法是茚三酮法。
酸性条件下,茚三酮和脯氨酸反应生成稳定的红色化合物,产物在520nm 波长下具有最大吸收峰。用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后,溶液即成红色,再用甲苯萃取,则色素全部转移至甲苯中,颜色的深浅即表示脯氨酸含量的高低。
【实验材料】
材料:
小麦幼苗:
(1)对照
(2)100mM、200mM NaCl处理48h
(3)5%、15% PEG-6000处理48h
试剂: 3%磺基水杨酸;冰醋酸;甲苯;% 酸性茚三酮溶液;脯氨酸母液50 μg/ml
器材:天平,烧杯,分光光度计,研钵,容量瓶,具塞试管,移液管,胶头滴管,水浴锅
【实验内容】
脯氨酸标准曲线的测定
(2)分别吸取1ml系列标准浓度的脯氨酸溶液于6个试管中,加入1ml水、1ml冰乙酸、2ml %的酸性茚三酮,于沸水浴中加热30min。
(3)冷却后准确加入4ml甲苯,振荡30S,静置片刻,使色素全部转至甲苯溶液。
(4)轻轻吸取各管上层甲苯溶液至比色杯中,以甲苯为空白对照,于520nm进行比色。
样品的测定
g, ml 3%磺基水杨酸试管中,沸水浴中提取10 min。
吸取1ml上清于另一试管中,加入1 ml水、1 ml冰乙酸、2 ml %的酸性茚三酮,混合液于沸水中显色30 min。
冷却后加入4 ml甲苯,摇荡30S,萃取完全后用吸管轻轻吸取上层红色甲苯溶液于比色杯中,以甲苯为空白对照,在520nm比色。
【实验结果】
查标准曲线,得脯氨酸含量c(µg)
脯氨酸含量( µ-1)= c ×(v/a )/w
其中V为提取液总体积ml; a为测定液体积ml;W为样品质量g。
标准曲线
浓度(µg/mL)
2
4
6
8
10
OD520
1





2





3





平均





样品测定
处理
平行
质量
OD520
对照
1




2


100mM NaCl
1




2


200mM NaCl
1




2


5%
PEG-6000
1




2