内毒素对人树突状细胞影响的体外研究.docx

山西医科大学硕士学位论文
实验一正常人外周血树突状细胞的体外诱导培养


选用我校在校大学生健康志愿者17例,其中男性9例,女性8例,平均年龄21岁
(19~23)岁。在知情同意的情况下采集每人10ml夕b周静脉血。

rhlL一4:PEPRO pany(5×104U/支)
rhGM-CSF:PEPRO pany(1×1 05U/支)
rhTNF—a:PEPRO pany(2X 105
U/支)
:PEPRO TECH
Company(2x 103/支)
LPS:Sigma公司
RPMI 1640:Gibco公司
FCS:Hyclone公司
淋巴细胞分离液:上海试剂二厂(Histopaque, g/m1)

超净工作台:JTT一7A,北京半导体设备厂
C02培养箱:Cell House
200,Hcto
.20℃低温冰箱:BCD212,青岛利渤海尔
.80℃低温冰箱:,日本
电热恒温水浴箱:
台式离心机:,上海科学仪器厂
:天津市天平仪器有限公司
倒置显微镜:XSE,重庆
微量加样器:GILSON,法国
ing

Incorporated,USA
1
4试剂配制

PBS液:KCl

、KH2P04 、NaCl 、Na2HP04 12H20

1000ml,PH
~,分装至500ml灭菌瓶中高压除菌。
RPMI
1640液:取1袋RPMI 1640粉,加入500ml
ddH20中,玻璃棒搅拌均匀,分
别称量Hepes -Gin ,直至ijl640液变澄清,颜色发黄,然后再加入
NaHC03液,可见1640液又变发红,)31]ddH20至1000ml,最后加入青霉素
和链霉素(100u/m1),用1N ,
250ml输液瓶,备用。使用时加入FCS使成为含FCSl5%的RPMI 1640完全培养液。
:肝素钠规格12500U/支。取肝素钠1支用生理盐水稀释至60ml,制成
浓度约200U/ml的稀释肝素钠,分装于10ml玻璃瓶中,9磅10分钟高压或滤过除菌,4。C保
存。使用时10mlP]"周血取2ml稀释肝素钠抗凝。
:
台盼蓝49,加少量三蒸水研磨,再加三蒸水至100ml,滤纸过滤,4
℃保存,%。

2

1外周血单个核细胞(peripheral

bIood monorlLIcIear

ce|l,PBMC)的分离
(1)采集健康志愿者外周血10ml置于50ml无菌瓶中,40u/ml肝素抗凝。
(2)在采集后1小时内用温热至37。C的PBS液稀释1倍,用吸管吹打混匀。
(3)在洁净玻璃离心管中加入淋巴细胞分离液,将稀释后的抗凝血沿管壁轻轻加在
淋巴细胞分离液面上使成界面。淋巴细胞分离液与抗凝血的体积比为1:l,以2500rpm,离
一t)25min,由上至下分离出血清、单个核细胞带(PBMC)、淋巴细胞分离液和红细胞四
条带。收集界面单个核细胞即白膜层于另一无菌玻璃管中。
(4)用PBS液稀释,分别以2000rpm、1500rpm、800rpm离心洗涤3次,洗尽血小板。
(5)以含FCSl5%的RPMI 1640完全培养基悬浮沉淀细胞,用吸管轻轻吹打混匀,调
整细胞浓度到3~5×106/ml铺于12孔板中。

DC体外定向诱导分化和培养
按照Romani[”】等分离培养树突状细胞方法稍作修改:
(1)外周血单个核细胞在37。C、5%的C02孵箱中贴壁2dx时,用预热的1640培养液轻
轻沈出未贴壁细胞。
(2)贴壁细胞加含FCSl5%的RPMI 1640完全培养基于12孔板中,每孔lml,按含
(1000u/m1)、(1000u/m1)和rh (50ng/m1)终浓度加入细胞因
子,置37。C、5%的c02孵箱中刺激诱导DC分化。
(3)隔日半量换液一次,含全量细胞因子,(1000u/m1),
共培养12天,第1l天加不同浓度的LPS,将细胞分组。每天观察记录细胞的形态和生长情
况。收细胞时进行细胞计数,并用台盼蓝拒染实验来检测细胞活力,同时计算D