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膜蛋白的提取方法-全攻略
一、膜蛋白简介
膜蛋白在细胞中扮演着重要的角色:例如被熟知的识别、信号转导、运输等功能,也是用药的理想的靶点,虽动物细胞主要有9种膜脂,而膜蛋白的种类繁多,多数膜蛋白分子数目较少,但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。
根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式,膜蛋白可分为两大类型:外在膜蛋白、内在膜蛋白。
(1) 外在膜蛋白为水溶性蛋白,靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合,因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来,膜结构并不被破坏。
(2) 内在膜蛋白与膜结合非常紧密,一般只有用去垢剂(detergent)使其膜解后才可分离出来。
附注:使用分级抽提方法获得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具备多跨膜区的整合膜蛋白。
二、膜蛋白的提取方法
谈及蛋白分离,我们想到:超速离心,盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法……有时这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。由于蛋白质种类繁多,不同的蛋白质由于结构和组成的差异,其溶解

,同时可选择不同的溶剂提取,分为水溶液提取和有机溶剂提取.
但是与胞质蛋白,核蛋白提取不同之处在于膜蛋白是嵌在膜中的,水溶性不好,基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等,然后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂,一般常用的有胆酸盐,CHAPS(一种离子去污剂),Emulgen和Lubrol等表面活性剂。
1)先分离膜,然后提取;如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎,然后通过梯度离心得到含有膜蛋白的粗组分。(例如:用液氮研磨组织,加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂,然后差速离心、蔗糖密度梯度离心。收集37%与41%间的成分,即为质膜部分。裂解即可收集膜蛋白)
2)用特殊的去污剂选择性的分离。从膜上提取蛋白有许多困难。在多数情况下,都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来,然后将蛋白质稳定。去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定,但在某些情况下,还要考虑到以后的纯化步骤。虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化,但最终仍可能需要除去去垢剂。这常常会引起蛋白质失活,但如果蛋白质是用于测序的,他将不是一个问题。如果不是用于测序的,,,, triton X-100在280nm处有吸收,如果某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关,就应避免使用这类去垢剂.
将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后,,而无需考虑胞质蛋白、,无论在种类上还是数量上,都比酸溶解法所得到的蛋白(<5000Da)%,所以充分的膜蛋白的提取,无疑对于研究膜蛋白的结构和