[硕士论文]hIGF-Ⅰ基因增强组织工程修复膝关节软骨缺损的实验研究.pdf

上海第二医科大学
博士学位论文
hIGF-Ⅰ基因增强组织工程修复膝关节软骨缺损的实验研究
姓名:张海宁
申请学位级别:博士
专业:外科学(骨科)
指导教师:侯筱魁
20050401
英文缩略词索引—’
二苯基四唑溴盐聚丙烯酰胺凝胶电泳甲基磺酰氟核糖核酸酶逆转录聚合酶链式反应十二烷基硫酸钠四甲基乙二钠,二甲基噻唑,自体骨软骨移植系统磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应群体倍增时间蛋白多糖透射电镜羟甲基被淄吸光度聚乙二醇上海第二医科大学博士学位论文一粂猼—猙
导『鼢歹帮日瓤选亡/、榷者蓉幺。讯瓣学位论文作者签名:散癌寺学位论文使用授权声明学位论文独创性声明阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除文中已经注嚼弓玫哪谌萃猓韭畚牟话渌鋈艘丫发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,··岁‘本人完全了解上海第二医科大学有关保留、使用学位论文的规定。学校有作者签名文中作了明确说明并表示谢意。权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复南口并允许论文进入学校图书馆被查和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。日期:.’甀日期;
基因增强组织工程修复膝关节软骨缺损的实验研究中文摘要研究目的;利用基因工程原理构建人胰岛素样生长因子ǔせ虻恼婧表达载体艵篲~.S肍H臼约两榈迹玥甀基因转染体外培养的骨髓基质干细胞和半月板细胞,检测转染效果及目的基因的表达情况,以期寻找一种改良组织工程种子细胞的新方法。建立全层无血运区半月板缺损模型,⑸湓逅岣颇盒薷窗月板缺损的效果。;τ肞方法从入肝细胞文库中提取全长的人胰岛素样生长因子ǔせ蛐蛄校寺∪隩载体校庑蛑な敌蛄姓确后,进行双酶切并定向插入真核表达载体小@盟盖小⒌,贴壁分离法接种培养骨髓基质干细胞。绘制生长曲线。壬ǚḿ觳庀赴盍ΑJ褂H臼约粒刈檎婧吮泶镏柿籈猦獻转染骨髓基质干细胞,转染后观察标志基因的表达效率及荧光强度的变化。酶联免疫吸附试验检测培养上清液中—呐ǘ取WH鞠赴榔衕狪及型胶原免疫组化染色检测—谋泶铩检测—蚢的表达。取培养上清行检测—鞍椎谋泶铩A魇较赴羌觳细胞周期的分布及荧光表达变化。蘧腥∫辉铝湫坌陨窖蛩ê笾ò朐掳澹剪碎后型胶原酶消化,接种培养半月板细胞,检测细胞活力。用导,将真核表达质粒一~狪转染半月板细胞,倒置荧光显微镜观察的表达。酶联免疫吸附试验检测分泌的—呐ǘ缺浠<扑转染前后细胞群体倍增时间。细胞爬片行虸徒涸庖咦榛旧ā觳鈎及的表达。流式细胞仪检测细胞周期的分布以及荧光表达。圃斐赡晟窖虬朐掳迩敖俏扪T饲ú闳彼鹉P汀R詇基因转染的骨髓基质千细胞复合可注射藻酸钙凝胶修复半月板缺损,同时设立未骨缺损的整合,提高修复质量。上海第二医科大学博士学位论文
组织中蛋白聚糖含量较高,但与正常半月板有差异。磁共振观察与大体观察类似。带出现。转染上清産觳庵な涤心康奶醮某鱿帧A魇较赴羌觳獗明转染后的骨髓基质干细胞诒壤黾印WH竞蟮牟糠窒赴翁⑸⒖赵靥遄楹投哉兆椤J鹾周、堋周处死动物,行大体观察,光镜、电镜观察,觳椋薷醋橹痑含量测定等比较修复效果。圃焐窖蛳ス亟诠晒趋凉侨砉侨彼鹉P停褂米制器械,植入本豆侨砉侵馇冻涮钊彼穑詇基因转染的骨髓基质干细胞复合可注射藻酸钙凝胶填充残余缺损。同时设立未转染~虻墓撬杌矢上赴椤楹投哉兆椤J鹾周、堋周处死动物,行大体观察,光镜、电镜观察,吆蚆觳椋觳庑薷醋织中含量并比较修复效果。┰∥坏阒小..蜃H境赡晟窖蚬撬杌视谙赴谧H旧锨逡褐蟹置呐ǘ缺浠琱狪免疫组化染色证实在胞浆中有—帕W派、和预期大小相符的条体外培养的成年山羊半月板细胞外侧区以长梭形为主,内侧区以多角形为主,混合区细胞形态为混合型。.蜃H竞罂晒鄄斓紼泶锏谋浠可检测到~谧H旧锨逡褐蟹置趆狪的浓度变化,—庖咦榛染色证实在胞浆中有帕W派粜浴证实有与—和て诖笮∠喾奶醮鱿帧A魇较赴羌觳庾H竞蟮陌朐掳逑赴鸖期比例增加;也可检测到荧光的表达。甴