[优秀论文]HBV核心抗原显性失活突变体抗HBV作用的研究.pdf

上海第二医科大学
博士学位论文
HBV核心抗原显性失活突变体抗HBV作用的研究
姓名:吴大勇
申请学位级别:博士
专业:内科学(传染病)
指导教师:周霞秋

#!!!!R弧!/方法:通过┰觯玫奖嗦胍腋尾《竞诵目乖鞍椎幕蚱诵目乖孕允Щ钔槐涮蹇笻作用的研究中文摘要/乙型肝炎病毒粲谑雀尾《荆úネ揪豆惴海蛟加其他治疗策略所不及的,因此具有很大吸引力。性化及肝病进一步恶化转为肝癌。目前应用的抗病毒治疗药物如扰素对乙肝的远期疗效仅为%一%。而新近开发的核苷类似物如拉到限制。因此研究新的抗病毒方法无疑具有重要意义。基因治疗可能为病毒性肝炎的治疗带来新的希望,正在成为研究热点。其主要研究为基础的抗病毒基因治疗策略还没有引起人们的重视。显性失活突变体是指突变后的蛋白质,对正常细胞中对应的未突变蛋白质的活性有抑制作用,是一种基于蛋白质水平的抗病毒基因治通过与相应的蛋白作用而干扰未突变的蛋白的功能。诵目乖显性失活突变体最大优点是它的作用不受病毒变异的影响,这一点是目的:设计并构建乙肝核,抗原突变体表达质粒,研究其在细胞内的表达及对病毒复制的抑制作用。亿慢性乙肝患者,而同时每年又有蛐略黾拥母腥静±K淙乙肝病毒感染可以通过疫苗或被动免疫方法预防,但是对慢性乙肝患者却缺乏有效的治疗,因此需要开发新的抗病毒药物以便减少乙肝慢咪呋啶也由于作用时间短,容易引起多聚酶突变形成耐药使其疗效受方向为核酸和寡核苷酸基因治疗,目前尚无突破性进展。而以蛋白质疗策略,多在原有蛋白基础上突变或重新组装而成。它的作用机制是上海第二医科大学级博士生论文,
检测表明乙肝核心抗原突变体可抑制粗拼。%以上关键讯集转染细胞,抽提细胞总肦狿方法检测狦融合基因转录片段。将转染细胞的爬片用激光荧光共聚焦显微镜观察融合蛋%蔗糖超速离心,结合免疫印迹方法检测蛋白的装配情况;最后,方法将巴槐涮逯柿9沧H镜紿合赴校嘌天后抽结果:所构建的突变体质粒经过酶切鉴定和测序鉴定正确,—检测到一清晰的融合基因片段;免疫印迹及激光荧光共聚焦显微镜检蛋白单体之间的聚合功能:将突变体质粒共转染到:细胞中,经内的复制,这说明突变体设计可以是多样性的,而且为进一步设计更高效的突变体载体提供了依据。乙肝核心抗原突变体将为治疗乙型肝显性失活突变体和编码绿色荧光蛋白的基因片段,利用基因工程亚克隆技术,。将构建正确的突变体质粒和空质粒经阳离子脂质体转染试剂榈妓彩弊H綡术细胞,收白在细胞内的表达情况;收集转染细胞,抽提细胞内总蛋白,通过免疫印迹方法检测融合蛋白的表达。收集并抽提转染细胞内总蛋白,经抽提突变体质粒一狦和空质粒,用磷酸钙转染提病毒核酸,通过定量觳馔槐涮宓谋泶锒訦复制的抑制作测到融合蛋白的表达:而蛋白聚合检测为阴性,说明突变体蛋白干扰结论:我们设计的突变体能够正确表达并能够有效降低谙赴炎提供新思路。用。上海第二医科大学级博士生论文\
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乙型肝炎病毒核心抗原突变体表达载体的构建第一部分琀渲シ⒄钩晌B愿尾。糠植∪顺鱿指嗡ソ摺R肝病毒携带者发生肝癌的危险性很高¨蛎磕晁烙贖引起的慢性乙型肝炎的抗病毒治疗目前主要依靠细胞因子如干扰索、胸腺素、及白介素等单独或联合使用,而效果并不理想。例如干扰素在发的抗病毒药物核苷类似物如拉米呋啶的效果也仅%左右,而且极分子水平直接阻断其中任何一个环节,就可以抑制病毒的增殖。根据这个设想近年来发展了寡核苷酸或核苷酸的基因治疗方法如核酶和反显性失活突变体是指突变后的蛋白质,对正常细胞中对应的未突显性失活突变体最大优点是它的作用不受病毒变异的影响,这一点是我国是乙肝高流行区,有近%的人口携带乙肝病毒肝癌的病人据报道每年约有偻蛐。因而严重影响患者的生命质量。对有选择的病例中,其对乙肝的长期疗效仅为%一%而新近开易引起病毒变异。免疫调节药物及中药的临床的应用也收效甚微。因为乙肝慢性化根本原因是病毒在肝细胞内持续的复制、表达,如果在义胺匆骞押塑账峒懊庖叩鹘谛曰蛑瘟迫鏒疫苗。但尚无突破性进展。而基于蛋白质水平的抗病毒基因治疗策略尚未引起人们足够的重视。变蛋白质的活性有抑制作用,是一种基于蛋白质水平的抗病毒基因治疗策略,多在原有蛋白基础上突变或重新组装而成。它的作用机制是通过与相应的蛋白作用而干扰未突变的蛋白的功能。诵目乖其他治疗策略所不及的,因此具有很大吸引力。鞣肿蛹涞男卜海第二医科大学级博畚
实验材料质粒和菌株:构成核心抗原突变体表达质粒一狦,为进一步研究其功能做准备。的重要结构之一,暮艘驴窃诓