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第三军医大学
硕士学位论文
核受体PPARγ结合小肽的筛选及初步功能鉴定
姓名:谢谆怡
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:江渝
20040501
第三军医大学硕士研究生论文
核受体结合小肽的筛选及初步功能鉴定

摘要

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)
是一类由配体激活的转录因子属于核受体超家族的成员 PPARs存在三种亚型 PPAR
PPAR / 和PPAR 其中PPAR 可由多种脂肪酸及其代谢产物激活在机体
糖类和脂类代谢中起到重要调节作用与2型糖尿病动脉粥样硬化高血压等多种代
谢性疾病以及炎症肿瘤等的发生密切相关目前 PPAR 作为多种疾病治疗的一个
重要靶分子正受到越来越多的关注
近年来发展较快的噬菌体肽库筛选技术正广泛应用于小分子药物设计重组疫苗
研制抗病毒药物筛选及细胞信号传导研究等领域其筛选的共同点是钓取与蛋白(如
抗体受体酶)特异性结合的配基这种筛选功能性短肽的策略对于PPAR 与其作
用分子的研究有很大的借鉴意义本研究表达纯化了PPAR 配体结合域(ligand bind-
ing domain, LBD)的his融合蛋白并以之为靶从噬菌体肽库中筛选结合PPAR 受体
的短肽对短肽分子进行了初步鉴定为进一步研究PPAR 作用的分子机理以及开发
以PPAR 为作用靶点的药物奠定了基础
本研究进行了以下工作
1 在大肠杆菌 BL21(DE3)中诱导表达核受体 PPAR 配体结合域的融合蛋白经
终浓度为 的 IPTG 在 20 诱导表达 12 小时重组 PPAR -LBD 融合蛋白
得到高效表达 SDS-PAGE 分析可见表达蛋白的分子量约为 34kD 近半数以可溶蛋
白形式存在
2 利用 Ni2 -NTA 纯化系统对表达蛋白进行有效纯化纯化蛋白在 SDS-PAGE
上呈现单一条带凝胶成像系统软件分析纯化蛋白的纯度大于 90%
3 以纯化的重组 PPAR -LBD 融合蛋白为靶采用固体包被法对噬菌体展示随
机十二肽库及环七肽库进行亲和筛选 ELISA 法鉴定特异结合的高亲和力阳性噬菌体
单克隆并测序获得与 PPAR -LBD 高亲和力的噬菌体展示十二肽单克隆 3 个环七
肽单克隆 5 个十二肽中出现 LXXLL 基序环七肽序列中包含较为特征性的 DXXRW
序列再经 ELISA 法从测序后的阳性噬菌体展示肽中选择与 PPAR -LBD 亲和力最
高的肽段进行多肽合成
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第三军医大学硕士研究生论文
4 利用 PPAR 的高亲和力配体 Rosiglitazone 与噬菌体小肽进行竞争性结合抑制
实验 Rosiglitazone 不影响噬菌体小肽与靶蛋白的结合筛选所得小肽与 Rosiglitazone
类配体的结合位点不同
本实验在大肠杆菌 BL21(DE3)中诱导表达并利用 Ni2 -NTA 系统分离纯化得
到了纯度较高的重组人 PPAR -LBD 融合蛋白利用噬菌体肽库筛选技术从噬菌体展
示十二肽及环七肽库中获得了具有 PPAR 结合活性的十二肽及环七肽序列它们与
配体 Rosiglitazone 的结合位点不同本实验为深入研究 PPAR 作用的分子机理及开
发以 PPAR 为作用靶点的药物奠定了基础

关键词 PPAR 蛋白纯化噬菌体表面呈现亲和筛选

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第三军医大学硕士研究生论文
Screening of Peroxisome Proliferator-activated Receptor
Gamma (PPAR ) Binding Peptides and Analysis of
Their Biological Functions

Abstract

Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) are nuclear receptors belonging
to the steroid/thyroid/retinoid receptor superfamily of ligand-activated transcription factors.
Three PPARs subtypes have been identified thus far and are termed PPAR , PPAR / ,
and PPAR . The PPAR receptor subtype, which is ac