毕业论文林伟斌课题结果汇总.doc

第一部分:荧光定量PCR实验
一、实验材料
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Bacto-trypton、Bacto-yeast extracion 英国OXOID公司产品
氨苄青霉素: : 为本实验室提供
T-载体质粒Pmd18 大连宝生物工程公司产品100bp ladder,λ-DNA EcoRⅠ/HindⅢ marker 华美生物工程公司产品
QIAE Ⅱ Agarose Gel Extraction Protocal 德国Qiagen公司产品
RESINcolumnTM小批量质粒DNA纯化系统华美生物工程公司产品细胞RNA提取试剂: Trizol 索奥公司产品
RT-PCR试剂索奥公司产品
逆转录酶系: 索奥公司产品
dNTPs: 索奥公司产品
DEPC 美国Sigma公司产品RNasin 美国Promega公司产品
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超净工作台: 苏州净化设备公司紫外分光光度计(UV-1206): 日本SHIMODZU公司产品冷冻离心机(SCR20B): 日本HITACHI公司产品台式低温高速离心机(Z323K) 德国HERMLE公司产品台式高速离心机(TGL-16G) 上海安亭科学仪器厂产品水平离心机上海安亭科学仪器厂产品
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80℃冰箱日本SANYO公司产品PE9700PCR扩增仪美国PE公司产品ABI310型DNA测序仪美国PE公司产品
PE7700荧光定量PCR扩增仪美国PE公司产品
二、实验方法
荧光定量RT-PCR检测HSP27方法的建立
荧光定量PCR是近两年发展起来的一项新技术[43-45]。其原理是在常规PCR扩增系统中加入一段与靶基因特异互补的荧光标记探针。探针的5'端标记有报告基团(Reporter, R),如FAM、VIC等。3'端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q),如TAMRA等。探针的3'端羟基已被封闭,不具有延伸功能。当探针完整的时候,报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收,仪器检测不到荧光信号。随着PCR扩增的进行,引物沿着模板延伸, Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针,其5'→3'外切核酸酶活性就会将探针切断,报告基团远离淬灭基团,其能量不能被吸收,即产生荧光信号。所以,每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。用荧光检测仪检测荧光值的变化,即可准确判定扩增产物的量。荧光定量PCR方法就是利用此原理,在PCR过程中,连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。当信号增强到某一阈值,此时的循环次数(用循环阈值Ct表示)就被记录下来。也就是说,荧光定量PCR不是对终点扩增产物定量,而是将检测点定在PCR产物消除荧光背景后进入指数增长期的起始位置,此时的扩增循环数也即是Ct,该循环数和PCR体系中起始模板的对数之间有着严格的线性关系,利用各梯度阳性定量标准模板扩增的Ct和定量模板数经对数拟合作图,制成标准曲线,再根据待测样品的Ct值就可以准确定出起始模板核酸的数量。
、探针的设计和合成
应用生物信息学知识,从Genebank中查阅出Hsp27和三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH,作为Real Time PCR的内参照)的DNA和mRNA序列,根据引物设计原则,并利用Primer ,设计出扩增大鼠(Rat)的Hsp27和GAPDH mRNA基因片段的引物。本实验所用的引物设计靠近5’端恒定区域并跨过两个内含子,避免扩增过程中DNA污染的可能。上游引物序列位于第1和第2外显子,下游引物序列位于第3外显子。引物(Primer)序列分别为:
Hsp27-F:5’-CCTCTTCGATCAAGCTTTCG-3’
Hsp27-R:5’-ACTGA-3’
GAPDH-F:5’-TCGTCTCATAG-3’
GAPDH-R:5’--3’
根据引物探针设计软件Primer ,按照荧光定量PCR探针设计原则,设计的荧光定量RT-PCR扩增Hsp27和GAPDH mRNA片段的探针序列。探针的5’端标记荧光发光基团FAM,3’端标记荧光淬灭基团TAMRA。
探针(Probe)序列如下:
Hsp27-P:5’-FAM-GATGAGTGGT-TAMRA-3’
GAPDH-P:5’-FAM-ATCTTG-TAMRA-3’
引物与探针是由北京索奥生物医药科技有限公司合成。