半滑舌鳎抗病相关SNP标记的筛选及两种免疫相关基因的克隆与初步分析-动物遗传育种与繁殖专业毕业论文.docx

。
飞、
。
向川立斗
上海海洋大学硕士学位论文
答辩委员会成员名单
姓名 工作单位 职称 备注
中
中国海洋大学 教授 王.::::;a:二 5E3
中国海洋大学 教授 当.::::;a:乏二 5E2
中科院沟洋所 研究员 王=ξL 5E=卫1
中科院海洋所 研究员 去.::::;ξa:二5E=1
江节r
中国水产科学研究院
| 副研究员 | 秘书
黄沟水产研究所
」一
lJE辩地点 黄海水产研究所 !答辩日期
半滑舌鳎抗病相关 SNP 标记的筛选及两种免疫
相关基因的克隆与初步分析
摘 要
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国特有的名贵海水养殖鱼类,其味道鲜美、口感爽滑、营养丰富,深受广大消费者喜爱,极具市场经济价值和养殖开发潜力。然而,高密度、集约化的养殖模式以及环境污染等原因,致使半滑舌鳎腹水、烂鳍、烂尾等细菌性疾病日益突出,严重制约了半滑舌鳎工厂化养殖产业的发展。将传统选择育种模式与分子标记辅助选择育种技术相结合,有利于半滑舌鳎抗性品系的培育,单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP) 被认为是一种极具应用前景的分子标记技术。本文以半滑舌鳎为研究材料,克隆了半滑舌鳎两种免疫相关基因 Nramp 和 IL-10,并进行了初步分析研究;利用直接测序法筛选了 Nramp 基因抗病相关的 SNP 分子标记,以期为半滑舌鳎抗性品系培育提供技术支持。主要研究结果如下:
1. 半滑舌鳎免疫相关基因的克隆与初步分析研究
利用 cDNA 末端快速扩增技术,对半滑舌鳎天然抗性相关巨噬细胞蛋白
( Natural resistance associated macrophage protein, Nramp ) 和白细胞介素 10
(Interleukin 10, IL-10)基因分别进行了克隆,并对其序列结构进行了分析研究。随后,对半滑舌鳎 Nramp 和 IL-10 基因感染哈维氏弧菌前后转录组水平的表达分析进行研究;并对半滑舌鳎 IL-10 基因原核表达进行了初步探索。
1)半滑舌鳎 Nramp 基因克隆与表达分析
Nramp 属于膜整合转运蛋白,具有抑制胞内寄生菌侵染、调节巨噬细胞抗菌活性等作用。本研究克隆了半滑舌鳎 Nramp 基因的 cDNA 序列,该基因全长 3717 bp,具有 16 个外显子,其中开放阅读框(open reading frame, ORF)为 1677 bp, 所编码蛋白含有 558 个氨基酸,该蛋白具有 Nramp 家族的典型特征:包括 10 个跨膜区(transmembrane, TM)、1 个由 20 个氨基酸残基组成的胞质内转运蛋白特征结构域(consensus transport motif, CTM)。半滑舌鳎 Nramp 基因其 ORF 末端有 1 个
I
类似于脊椎动物 Nramp2 中的铁反应控制蛋白结合位点( iron-responsive
regulatory-protein-binding sites, IRE)。半滑舌鳎 Nramp 与其他 14 个物种的 Nramp 氨基酸序列同源性在 63~91%之间,系统进化分析表明,半滑舌鳎 Nramp 和所有鱼类 Nramp 聚集为一簇,与其他物种 Nramp2 的亲缘关系较近。实时荧光定量 PCR 分析表明,Nramp 基因在半滑舌鳎脾脏和肾脏中的表达量最高,而在肌肉和性腺中的表达量最低;在哈维氏弧菌感染后的半滑舌鳎肾脏、脾脏和肝脏中表达量呈升高趋势,而在鳃中则表现为下调趋势。
2)半滑舌鳎 IL-10 基因克隆与原核表达
IL-10 是一种具有广泛作用的细胞因子,其主要功能是抑制和终止炎症反应。本研究克隆了半滑舌鳎 IL-10 基因的 cDNA 序列,该基因全长 935 bp,具有 5 个外显子,其 ORF 为 561 bp,所编码蛋白含有 186 个氨基酸,包含 4 个保守的半胱氨酸残基构成 2 对二硫键, 该蛋白具有 IL-10 家族的特征序列: G-X2-KA-X2-[D,E]-X-D-[ILV]-[FLV]-[FILMV]-X2-[ILMV][EKQR]。半滑舌鳎 IL-10
与其他 15 个物种的 IL-10 氨基酸序列同源性在 27~62%之间,系统进化分析表明, 半滑舌鳎 IL-10 与红鳍东方鲀、大西洋鳕、欧洲鲈鱼和青斑河豚的亲缘关系最近, 聚集为一支;而在高等动物中与原鸡的亲缘关系最近。实时荧光定量 PCR 分析表明,半滑舌鳎 IL-10 mRNA 主要在肝脏、心脏、皮肤和肠中表达;在哈维氏弧菌感染后的肝脏和鳃中表达量呈下调趋势,而脾脏则表现为升高趋势。