实验报告-硝酸还原酶活性的测定.doc

首都师范大学生命科学学院实验报告
课程名称植物生理实验实验时间 成绩
姓名唐倪文班级 3 学号 1090800032
实验题目硝酸还原酶活性的测定
一、实验原理
硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶,硝酸还原酶作用于NO3-使之还原为NO2-。
NO3- + NADH+ + H+ → NO2- + NAD+ + H2O
产生的NO2-可以从植物组织渗透到外界溶液中,积累在溶液中。因此,测定反应液中NO2-含量的增加即表明酶活性的大小。
NO2-含量的测定----磺胺法
NO2-与磺胺和a-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物,用比色法在520nm下读取光密度值。
二、实验用品
:完全营养的小麦苗,缺氮培养的小麦苗
:722型分光光度计,剪刀,真空泵,电子天平,温箱,烧杯,移液枪,tip头(两种规格:1000μl,200μl)
三、实验步骤

(1) + 蒸馏水5ml
(2) + 5ml
2. NO2-的获得
(1),剪成小片,分别置于小烧杯内的反应液中。
(2)在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部,溶液即可渗入组织内取代其中的空气,内部产生的NO2-可渗透到外部溶液中。
℃温箱,使其不见光,保温20min。
NaNO2母液配制标准梯度溶液5、4 、 3 、 2 、 1 、 、、0 μg/ml。
,加入磺胺试剂2ml及α-萘胺试剂2ml,混合均匀,在60℃水浴中保温20min,于比色杯中,在520nm下进行比色,读取光密度,然后做出光密度—浓度曲线,以光密度为纵坐标,NaNO2浓度为横坐标。具体步骤及结果如下表和下图所示。
试剂
管号
1
2
3
4
5
6
7
8
NaNO2母液(ml)
0







蒸馏水(ml)
1






0
1%磺胺(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
%α-萘胺(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
每管亚硝酸氮含量(μg)
0







每管NaNO2浓度(μg/ml)
0







光密度
0







标准曲线:
5. 吸取反应液各1 ml于试管中加入磺胺和a-萘胺各2 ml,60℃水浴20min,,从标准曲线上查得NO2-的含量,结果如下表。
小麦幼苗
完全培养液
缺N培养液
KNO3
H2O
KNO3
H2O
小麦鲜重(g)




光密度