八、检测口蹄疫病毒抗原方法.doc

八、检测口蹄疫病毒抗原的方法
(一)口蹄疫反向被动红细胞凝集试验(反向被动血凝)
红细胞膜具有吸附抗原或抗体的特性,将提纯的口蹄疫抗体(IgG),当这种被致敏的红细胞(即红细胞表面均带有口蹄疫抗体),遇到相应的口蹄疫病毒抗原时,便产生抗原抗体的特异性反应,从而使红细胞发生肉眼可见的凝集现象。该法快速、简便、准确、可同步鉴定出口蹄疫毒型和鉴别口蹄疫、猪水泡病病原。

V型96孔130o血凝滴定板、玻璃吸管(1毫升、5毫升规格)、玻璃中试管(内径15毫米,长度100毫米)、试管架、微量振荡器、微量移液器、塑料咀、玻璃板(与血凝板大小一致)、口蹄疫O、A、C、Asia-I 型、SVD(猪水泡病)反向被动血凝诊断试剂及其配套用的口蹄疫各型、猪水泡病阳性抗原、阴性抗原、稀释液、待检抗原。

(1)稀释待检抗原取中试管8支,横列于试管架上,每管各加入稀释液1 毫升,取待检抗原1毫升加入第1管混匀后从中取出1毫升加入第2管,混匀后取1毫升加入第3管……直至第8管,此时待检抗原的稀释度依次为1:6、1:12、1:24、1:48、1:96、1:192、1:384、1:768。
(2)稀释阴性抗原取中试管1支用记号笔标明“阴抗”字样,加入稀释液390微升,加入阴性抗原10微升,充分混匀,此时阴性抗原的稀释度为1:40。
(3)稀释阳性抗原取中试管20支,横列于管架标明“阳抗”字样,每排4支,(O型4支、A型4支、C型4支、Asia-1型4支、SVD4支)。每种阳抗第1管,,第2~。(100微升),加入第1排的第2管并充分混匀,。
其他阳性抗原均按上法稀释,注意每稀释一种阳抗必须更换1支吸管,切勿混杂以免影响反应的特异性。经过上述稀释,各阳性抗原的稀释度依次为1:48、1:96、1:192和1:384。用于阳抗对照孔的只加第4管(1:384)的阳抗。
(4)滴加待检抗原和对照抗原取第8管稀释的待检抗原(1:768)加入血凝滴定板上的1~5排的第8孔,每孔50微升,取第7管待检抗原(1:384)加入1~5排的第7孔,取第6管待检抗原(1:192)加入1~5排的第6孔……直至第1孔,每孔均为50微升。1~5排的第10孔加入1:40的阴性抗原,每孔50微升。1-5排的第11孔依次加入O、A、C、 Asia-1型和SVD1:384稀释度的阳性抗原,每孔50微升(即第1排的第11孔加O型抗原;第2排的11孔加A型抗原;第3排的11孔加C型抗原;第4排的11孔加Asia –1型抗原;第5排的11孔加SVD抗原)。1-5排的第12孔各加稀释液50微升作为稀释液对照。
(5)滴加反向被动血凝诊断液血凝板上的第1排1~8孔和10~12孔加O型诊断液,每孔25
微升。第2排1~8孔和10~12孔加入A型诊断液,每孔25微升。第3排1~8孔和10~12孔加入C型诊断液,每孔25微升。第4排1~8孔和10~12孔加入Asia-1型诊断液,每孔25微升。第5排1~8孔和10~12孔加入SVD诊断液,每孔25微升。