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安宫牛黄丸对大鼠重型颅脑损伤后神经细胞凋亡及相关基因Bcl—2表达的影响
颅脑创伤是最常见的神经外科疾病,不仅病死率高且存活的患者中大多遗留有不同程度的后遗症,研究表明细胞凋亡是颅脑创伤后继发性损伤中主要的细胞死亡形式之一[1-2]。安宫牛黄丸是临床上治疗高热惊厥、脑卒中的要药,并逐渐开始应用于急性期颅脑损伤的治疗,但其临床治疗机制尚不明确。本研究观察安宫牛黄丸对大鼠创伤性颅脑损伤后神经细胞的凋亡及Bc1-2基因表达的影响,从而探讨安宫牛黄丸对脑外伤后神经细胞凋亡的影响和可能的机制。
1 材料与方法
实验动物
雄性SD(Sprague Dawley)大鼠,体质量250~350 g,清洁级,由上海斯莱克实验动物有限公司提供,质量合格证号:SCXK(沪)2012-0002。实验前适应性喂养1周。
仪器及试剂:RM2135转式切片机,TP1020全自动组织脱水机,EG1140型石蜡包埋机,以上均LEICA公司;BM-1000显微镜;DRP-9082型电热恒温培养箱,上海森信实验仪器有限公司;H1650R和 TDZ6B-WS台式高/低速冷冻离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司。SPECTRA max Plus 384酶标仪,Molecular Devices公司;Mini-Proten Tetra电泳系统,Bio-RAD公司。
实验试剂:安宫牛黄丸,生产批号111004,杭州市胡庆余堂有限公司;聚偏氟乙烯膜(PVDF),Millipore公司;超敏ECL化学发光(ECL Plus)试剂盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)缓冲液(5×)、Western及IP细胞裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)购自碧云天公司。Bc1-2抗体:BS1511,Bioworld。β-Actin 抗体:sc-47778,Santa Cruz。山羊抗兔IgG二抗(Goat anti-Rabbit IgG-HRP):BS13278,Bioworld。辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(Goat anti-Mouse IgG-HRP):BS12478,Bioworld。其余试剂均为国产分析纯。
实验步骤
颅脑损伤模型的建立大鼠随机(随机数字法)均分为模型组、治疗组2组。模型组和治疗组大鼠均以Feeney法制作大鼠重型颅脑损伤模型:苯巴比妥麻醉(40 mg/kg, ip)后将其固定于立体定向仪上。备皮、消毒后作头皮正中切口并暴露右顶骨,以冠状缝后2 mm、中线旁开3 mm为中心开5 mm×5 mm骨窗。在保持硬膜完整的前提下对骨窗下右顶叶脑组织施以坠物撞击:40 g重物自25 cm高处沿滑杆垂直落下打击撞垫(撞击力= N·s),制作颅脑创伤的大鼠模型。治疗组在造模前1 g/(kg·d),每日一次,共7 d。
标本的采集每组于损伤后6、24、48、72、168 h 5个点各取约5只大鼠处死,完整取出脑组织,按照指标检测用标本的要求进行预处理。
指标的检测采用TU