蚂蝗抗凝血酶活性物质提取工艺改进.doc

蚂蝗抗凝血酶活性物质提取工艺改进.doc蚂蝗抗凝血酶活性物质提取工艺改进
【关键词】水蛭素; 蛋白质; 正交实验; 提取工艺
水蛭是传统的破血逐瘀药,始载于《神农本草经》,《中国药典》2005年版收载了水蛭Hirudo nipponica 型高速冷冻离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司),HHZ-4型恒温水浴锅(郑州长城科工贸有限公司),微量移液器(DRAGON-MED),Spe-54型双光束紫外分光光度计(上海棱光技术有限公司)。
材料水蛭药材购于河北安国中药材市场(经佳木斯大学药学院生药学教研室刘娟教授鉴定为蚂蝗A,F8630-200mg,凝固物含量为75%);牛血清白蛋白(BSA,SIGMA,A730-5g,98%);Tris碱、盐酸、生理盐水、硫酸铜、酒石酸钾钠均为国产分析纯。
2 方法与结果
溶液的制备根据相关文献资料和预试验[3],取水蛭干燥全体用锉刀锉成细粉,称取水蛭细粉9份, g。以生理盐水为提取溶剂,以提取次数、提取温度(℃)、提取时间(min)和提取溶剂倍量为考察因素,每个因素选择3个水平,以测得的水蛭素的含量和蛋白质的含量计算得出的水蛭素比活力作为考察指标。选用L9(34)正交表进行实验,对中药水蛭中水蛭素的提取工艺进行研究,并对结果进行方差分析和显著性检验。各因素及水平见表1,正交实验设计方案及结果见表2。
水蛭素活力的测定精密量取提取液上清液100 μl,置试管(20 mm×10 mm)中,%牛纤维蛋白原(以凝固物计)的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液200 μl,摇匀,置37℃水浴中预温2 min。缓缓滴加20 IU·ml-1的凝血酶溶液(每1 min不超过5 μl, IU的凝血酶),边滴加边轻轻摇匀,至出现丝状凝固,记录消耗凝血酶溶液的体积。按下式计算抗凝血酶活性(U):U=20(IU·ml-1)×V(ml)×l)。其中,V为消耗凝血酶溶液的体积,g·ml-1)0,,,,, ml,用蒸馏水补足至2 ml,分别加人4 ml双缩脲试剂在室温下放置30 min,置于540 nm波长处比色,测得吸光度值分别为0,,,,,,以吸光度(A)为纵坐标,牛血清白蛋白含量(C)为横坐标绘出标准曲线,以最小二乘法得其线性方程为A= 3×10-3C+×10-3,r= 8,表明在此浓度范围内有良好的线性关系。
双缩脲试剂的配制取硫酸铜试剂(CuSO4·5H2O) g和6 g酒石酸钾钠(NaKC4H4O6·4H2O)溶于500 ml蒸馏水中,再加入300 ml10%的NaOH溶液并不断搅拌,用蒸馏水定容至1 000 ml容量瓶中,放冷待用。
实验结果以水蛭素含量和蛋白质含量来计算水蛭素比活力为综合评价指标,。由表2可知因素C的极差最小,也就是对本试验的影响最小,所以以此项为误差项进行方差分析。结果见表3。
根据正交实验结果、直观分析及方差分析结果可见各因素对水蛭素得率影响的顺序为:A>B>D>C。由表3可知,,对实验结果影响显著,,说明因素D对实