罗汉果甜苷的分离方案.doc

罗汉果甜苷IV和罗汉果甜苷V的检测和分离
前言: 根据毕设结果可知论文研究阶段采用的罗汉果为新鲜罗汉果,但在检测含量时并未检测到罗汉果IV的存在,可能原因有如下:
(1)旋转蒸发过程中出现大量的泡沫,这是由于罗汉果甜苷对蛋白质有很高的起泡性,这一过程可能造成了罗汉果IV转化或者丢失;
(2)由于罗汉果甜苷IV的含量极低,可能是由于检测器不灵敏造成无法检测到含量;
(3)检测方法、流动相的比例、选择、检测波长不对,有文献表明采用C18柱,当乙腈的含量为24%,检测波长为210nm时能很好的检测到罗汉果IV的含量;
(4)大孔树脂的选型问题,都不能很好的吸附到罗汉果IV;
(5)实验操作不规范导致提取率极低;
(6)可能是采集来的罗汉果存储时间过长,或保存方法不当导致罗汉果IV已经发生了转变;
针对以上失败原因分析现整理出新的罗汉果甜苷IV和罗汉果甜苷V的检测和分离的方案如下:
1 选果
采用坐果大概30天的新鲜罗汉果,有实验研究表明此时罗汉果甜苷V的含量最高。
2 提取以及去除杂质
(1)提取方法:采用微波提取
(2)出去杂质多糖、纤维素、果胶
进行水提醇沉(将粗提取液进行浓缩,加乙醇,是乙醇的最终浓度控制在70%以上,多糖、纤维素、果胶等都不溶于高浓度的乙醇溶液)。
(3)去除纤维等
将醇沉后的过滤液过半透膜,以去除纤维素等杂质。(淀粉、纤维素的分子直径都在1~100nm之间,属于胶体的范畴,不能透过半透膜。可以加水后,用半透膜渗析除去) 。
去除酯类
用石油醚进行萃取。
3 过柱
树脂型号的选择
采用大孔树脂吸附,可供采用的树脂型号AB—8、D201、HPD100、HPD722。
4 分离
洗脱液的选择:
(1)首先用20%乙醇进行洗脱,20%乙醇冲洗都能很好地在除去蛋白和多糖。
(2)洗脱液可以选择浓度分别为40%、65%、90%的乙醇、甲醇、丙酮、乙腈等,对洗脱剂进行逐一的实验探索。(由于制粉的过程也是可能导致罗汉果甜苷IV丢失的一个原因,所以可以直接取过柱液拿去用高效液相进行测定含量,方法见下文。或者采用薄层层析法,定性的判定罗汉果甜苷IV和甜苷V的量。展开剂为24%的乙腈水溶液)
5 高效液相色谱法测定含量
采用C18柱,乙腈的含量为24%,,检测波长为210nm。
6 罗汉果甜苷IV和甜苷V的分离和制备
(1)直接采用制备型的高效液相
(2)硅胶柱层析分离,以24%的乙腈水溶液或者三氟乙酸—水溶液为展开剂。
(3)加入纤维素酶,探究其对罗汉果甜苷IV以及甜苷V含量的影响。

附录
水提醇沉(转)
(2009-06-16 13:45:27)
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关于醇沉的知识整理如下:
水提醇沉淀法(水醇法):先以水为溶媒提取药材有效成分,再用乙醇沉淀除去杂质的方法。利用水、乙醇对有效成分和无效成分溶解度的不同使之分离精制。
(一) 工艺依据:通常含醇量 50~60%时淀粉、多糖沉淀。60%或70%以上,除鞣质、树脂外,大部分被除掉。
(二) 操作
中药,加水煎2~3次,过滤,滤液浓缩至1:1~1:2(ml:g)-,
加适量乙醇,使含醇量达一定要求(50~60%,