酸性磷酸酶活性测定方法.docx

实验九 酸性磷酸(酯)酶活性测定

掌握酸性磷酸(酯)酶活性测定的原理和方法。

酸性磷酸 (酯) 酶是一种存在于生物体内水解有机磷酸酯键的酶。 以对硝基酚磷酸钠作
为底物, 在酸性磷酸酯酶的作用下, 在碱性条件下水解生成黄色的对硝基酚, 可用分光光度
计进行比色测定。它们在各类种子中普遍存在,且含量较多, 在萌发前期, 随着种子的萌发
进程活性增加,通常酸性磷酸酶活性与种子活力呈正比。

干种子或吸胀种子、电子天平、分光光度计、恒温水浴箱、带塞刻度试管、小烧杯、研
钵、塑料管、剪刀。

掌握常用的测定酸性磷酸(酯)酶活性的方法 —— 对硝基酚磷酸钠法。

( 1)酶液提取。称取 1g 样品,用 5mL 研磨缓冲液在研钵中冰浴研磨成浆,再用 5mL
研磨缓冲液冲洗,转移至离心管中,在 20000rpm 下离心 10min 。吸出上清液,即为酶粗提
液。可放在冰箱中储存备用。
( 2)活力测定。取酶液 — 1mL (视酶含量多少而定) ,加水至 1mL ,然后加入缓冲
液 1mL 和对硝基酚磷酸钠溶液  。空白对照用 1mL 研磨缓冲液代替酶制剂。充分混匀
后,放在 30℃恒温箱中保温 10min ,时而摇动。 10min 后,加入  溶液,充
分混合,终止反应,并使对硝基酚呈黄色。在 400nm 波长下测吸光度 A 。
( 3)计算酶活性,以每毫克种子每分钟水解底物的 nmol 数表示。
试样的 A



V
V 1
酶活性 nmol/=
(
10 min ) W( g)
式中  为 pH=14 时,对硝基酚的 μmol 吸光系数,即对硝基酚的浓度为 1mol/L 时,
其 A= ;
×
 为  1000,反应混合液的体积为 ,将 μmol 化为 nmol 乘上 1000;
V 为酶制剂总体积;
V1 为每次用酶体积。
在实验中要保持酶制剂处于低温下以免酶活性下降,可在冰箱中提取和保存。