实验九 动物组织中核酸的提取和鉴定.doc

【原理】
动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖孩酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。核蛋白可被三氯醋酸沉淀,再用95%乙醇加热可以除去附着在沉淀上的脂类杂质,然后用10%NaCl溶液提取出核酸的钠盐,加入醇可使核酸钠沉淀析出。
先用水由动物肝中提出核蛋白,再籍酚将核酸与蛋白质之间的结合键断裂,并用乙醚抽提去蛋白质及其它杂质,最后用乙醇将核酸沉淀。
核酸(RNA、DNA)可被硫酸水解产生磷酸。有机碱(嘌岭、嘧啶)和戊糖(核糖、脱氧核糖)。
此三类化合物可用下列方法鉴定之。
1、磷酸:能与钼酸试剂作用生成磷钼酸,后者在还原剂的作用下。还原成兰色的钼兰。常用的还原剂有氨基苯磺酸、氯化亚锡,维生素C等。
H3PO4+12H2MoO4→H3PO4·12MoO3 + 12H2O
H3PO4·12MoO3 H3PO4·6MoO3 ·3Mo2O5
2、嘌呤碱:能与苦味酸作用形成针状结晶
3、戊糖:
(1)核糖:经与强酸(盐酸与硫酸)共热生成糠醛,后者可与3;5二羟甲基苯缩合成绿色化合物。
(2)脱氧核糖:在强酸中加热,可生成ω—羟基γ—酮基戊醛,后者再与二苯胺作用生成一蓝色化合物。
上述二反应如下
【操作】
(一)核酸提取
l、用酚提取法:
(1)取小白鼠一只,断头处死,剖腹取肝,置于研钵中,加入玻璃少许,研磨至糊状后,加入蒸馏水3ml,继续研磨约三分钟。
(2)于该研钵中再加酚液5ml,研磨约十分钟后,倒入—-圆底离心管中,离心5分钟(约2000转/分钟)。
(3)用毛细管将上液吸出,置于一圆底离心管中,加乙醚2ml,用拇指将管口按住,用力振摇1—2分钟(提出酚),离心5分钟后,用毛细滴管吸取全部下层液于一圆底离心管中。
(4)于该管中加入95%乙醇2ml,用玻棒搅拌约2分钟,离心3分钟,,沉淀部分即为核酸。
2、用三氯醋酸提取法
(1)杀兔;取肝,称重,按每克肝脏4ml比例加入1%三氯醋酸,制成肝匀浆。每组量取肝匀浆5ml于带塞离心管中,3000转/分离心5分钟。
(2)将离心后的上清液倾去,于沉淀中加95%乙醇5ml充分混匀,在水浴中加热至沸2分钟,注意酒精沸腾后将火关小,避免酒精蒸汽燃烧。冷却后离心。
(3)倾去上层乙醇液。于沉淀中再加入10%NaCI溶液4ml,置沸水浴中8分钟,并用玻棒不断搅拌,取出;冷却后再离心,
(4)将上清液倾入另一离心管中,再离心一次,除去可能存在的微量残渣,将上清液倒入一试管。
取等量95%的乙醇,逐滴加入到上清液中,即可见白色沉淀逐渐出现,静置10分钟后。将其内容物摇匀后倒入一圆底离心管中,离心5分钟,将上液倾去,所得白色沉淀即为核酸钠。
(二)核酸的水解:
在有核酸沉淀的离心管中加入蒸馏水2ml。振摇至沉淀溶解后,加入10%H2SO42mL摇匀,于沸水浴中加热10分钟,即得核酸水解液,用流水冷却后进行下列定性试验。
(三)鉴定:
l、嘌呤碱的鉴定:
取中试管一支,加入饱和苦味酸约2ml,再加入核酸水解液4—6滴,摇匀。静置于室温中,观察有无黄色针状结晶出现,。
2、脱氧核糖的鉴定:
取中试管2支,标号、按下表操作:
管号
试剂
核酸水解液
5%硫酸
二苯胺试剂
1(测定管)
24滴
—
30滴
2(对照管)
—
24滴
30滴
摇匀,于沸水浴中加热15分钟后,观察二管颜色之变化。
3、核糖的鉴定:
取中试管2支,标号,按下表操作:
管号
试剂
核酸水解液
5%硫酸
拜耳氏试剂
1(测定管)
6滴
—
9滴
2(对照管)
—
6滴
9滴
摇匀,于沸水浴加热10分钟后观察色颜色之变化。
4、磷酸的鉴定
取中试管二支,标号、按下表操作:
管号
试剂
核酸水解液
5%硫酸
钼酸试剂
3%维生素 C
1(测定管)
10滴
—
5滴
4滴
2(对照管)
—
10滴
5滴
4滴
摇匀,于沸水浴中2~3分钟后,观察二管颜色之变化。
【试剂配法】
1、饱和苦味酸溶液:,溶于100ml的蒸馏水中,静置过夜。临用前倒取上层液。
2、钼酸试剂,称取钼酸铵5克,溶于100ml蒸馏水中,再加入浓硫硫15ml待冷却后加蒸馏水至1000ml,此试剂可置阴凉处保质一月。
3、拜耳(Bial)氏试剂:,5一二羟甲苯,加入浓盐酸50ml。再加10%三氯化铁20—30滴,贮于冰箱。此试剂应在临用前配制。
4、二苯胺试剂:称取纯二苯胺lg溶于1000ml的冰醋酸中,,贮于棕色瓶中,此试剂亦需临用前配制。
5、3%维生素C:称取维生素C 3克溶于5%三氯醋酸100ml中(已氧化