DNA和质粒抽提.ppt

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第一部分 DNA提取总论
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一、提取DNA总的原则:
1 保证核酸一级结构的完整性;
2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度;
3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子;
4 其他核酸分子,如RNA,也应尽量去除。
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二、样本来源:
理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都可以提取DNA
样本选择取决于试验目的
全血是基因组提取最常见的样本
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血清、血浆、外周血有核细胞、痰液、体液、棉拭子采集的各种分泌物、组织(包括骨髓)和羊水等都是分子诊断的检验材料,其中全血、血浆(血清)标本占分子诊断的60%以上
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DNA提取前样本采集、预处理和保存:
(一)全血

EDTA-Na2
或枸橼酸钠
作为抗凝剂
不宜使用肝素
抗凝剂处理血
肝素
柠檬酸*
EDTA*
-80℃
保存2个月,第10天收率90%
4 ℃
第四天收率90%
第10天提取效果差
第十天收率85%
室温
提取效果差
第四天收率90%
第十天提取效果差
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mRNA逆转录后RT-PCR结果(0、3、6个月)
A B C D
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(二)血浆和血清
血浆和血清是检测释放入血的游离核酸最主要的标本来源,用来检测病毒、细菌,以及肿瘤细胞等等释放出来的游离核酸和蛋白质产物,在临床上被广泛应用于病原微生物和肿瘤标志基因的检测中
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血浆DNA又称为循环DNA,是一种无细胞状态的胞外DNA,主要是游离的单链、双链DNA或DNA-蛋白质的混合物
它在未来分子诊断的应用中具有广阔前景
血浆DNA成分的来源分为内源性和外源性两个部分,其中入侵的病毒、细菌等病原体释放入血液的核酸是外源性血浆DNA最重要的成分
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血浆DNA
内源性循环DNA
外源性循环DNA
自身基因组来源DNA
入侵的病毒、细菌等病原体
死亡细胞
活细胞释放
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