ELISA法血清抗体检测免疫胶体金法检早孕 - 副本.ppt

第四次试验ELISA法血清抗体检测免疫胶体金法检测早早孕
免疫学教研室
※重点实验※(写实验报告)
& 血清抗体的检测:
第一周:免疫小鼠(腹腔注射5%绵羊红细胞SRBC)、EILISA板抗原包被以及封闭

第二周:小鼠眼球取血分离血清(96h后已经产生特异性抗体,存在血清中)

第四周:ELISA实验检测血清中
抗体水平(ELISA后续步骤)
成绩
课堂表现及出勤情况,占5分
实验报告,占10分
期末考试,占10分
复习第一次课操作
SRBC冻融稀释(得到比例适当的抗原,非完整的红细胞)
↓
每孔加包被液(碳酸盐缓冲液,含抗原)100μl, 37℃ 1h (包被)
↓
弃去孔中液体,用PBS洗板3次,每次均拍板
↓
加封闭液,每孔200μl,37℃,30min (封闭)
↓
弃去孔中液体,用PBS洗板3次,排干后4度保存
包被和封闭ELISA板(复习)
包被和封闭是ELISA前两个步骤,第一次课已经完成。
包被就是将已知抗原或抗体非特异性,物理性吸附于固相载体表面并保持其免疫学活性。
封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙,从而防止在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。
洗涤:不论是包被还是封闭后,我们都用PBST洗液洗涤三次,目的是去除游离的未结合的物质,从而保证试验结果的特异性及稳定性。
阳性
阳性
阴性
待测一
阴性
待测一
待测二
待测二
1 待测一本组待测血清样本1:20稀释,
待测二邻组待测血清样本1:20稀释。
2 1:20稀释 50μl待测血清+950μl PBS
3 每孔加对应液体(注意混匀)100μl,阳性孔和阴性孔分别加入100μl的阳性、阴性对照液。加不同液体注意更换枪头,不要串孔。并做好标记
5 统一放入37度孵箱1h(大于1h)
ELISA步骤
包被
↓
封闭
↓
加入待测样本
↓
加入酶标二抗
↓
加入底物
↓
加入终止液,终止反应
加入酶(HRP)标记二抗
1 弃液
2 用PBS洗板3次,200μl/每孔,每次一分钟以上,水平轻微晃动,切勿串孔、溢出。每次洗完用滤纸拍板,拍干。
3 于8个ELISA孔中加入酶(HRP)标记二抗,100μl/每孔。
4 加完后统一放入37度温箱1h(大于1h)。
加入底物-酶促反应-反应终止
1 弃液
2 用PBS洗板7次,200μl/每孔,每次一分钟以上,水平轻微晃动,切勿串孔、溢出。每次洗完用滤纸拍板,拍干。
3 于8个ELISA孔中分别加入底物100μl/每孔。
4 加完后,室温避光反应10min。
5 反应10min后,于8个ELISA孔中分别加入终止液,50μl/每孔。