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第六章医学标记免疫分析
随着科技的进步和仪器设备的更新,包括医学标记免疫分析等技术在内的我免疫分析是将多种标记示踪技术与医学免疫学抗原抗体反应相结合的一系列分析方法,包括体外放射分析、化学发光免疫分析、时间分辨荧光分析和酶标免疫分析等技术。目前,医学标记免疫分析技术的发展日新月异,各项技术之间互相借鉴、互相融合,其应用已不局限于核医学领域,检验科、临床实验室等也已广泛应用该类技术。本章以核医学常规应用技术为主来介绍医学标记免疫分析技术。
体外放射分析是指在体外条件下,以放射性核素标记的配体为示踪剂,以免疫结合反应为基础,以放射性测量为定量手段,对微量物质进行定量分析的一类分析方法的总称。按其方法学设计可分为两种类型:竞争性放射分析(如放射免疫分析)和非竞争性放射分析(如免疫放射分析)。按标记的配体不同又可分为:放射免疫分析、免疫放射分析、放射受体分析、受体放射分析、蛋白质竞争结合分析和放射酶促分析等。近年来,化学发光免疫分析与时间分辨荧光分析发展非常快,在很大程度上已经取代了传统的体外放射分析技术。与放射免疫分析技术相比,化学发光免疫分析与时间分辨荧光分析的优势在于:(1)标准曲线稳定,定标一次后可稳定1周至数月。这不仅减少了试剂消耗,还实现了临床快速检验。(2)试剂货架期长,可长达数月至1年。(3)没有放射性污染问题。(4)加样、反应、分离、测定等操作实现了全自动化,减少了实验误差。目前,研制的化学发光免疫分析与时间分辨荧光分析试剂药盒种类逐步增多,成为核医学科临床体外分析方法的发展方向。
第一节放射免疫分析
petitive radioassay)是一系列体外超微量放射分析技术的总称,工作原理均为利用标记物与特异结合剂发生竞争性结合反应,从而对极微量的生物活性物质做定量分析。放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA)是此类方法中创建最早、应用最广的具有代表性的方法。1959年Berson和Yalow首先利用抗胰岛素抗体作为特异性结合剂,标记胰岛素作为示踪剂建立了血浆胰岛素的微量测定法,命名为RIA,并因此获得了1977年诺贝尔生物医学奖。
一、放射免疫分析的基本原理
RIA是利用放射性核素标记抗原与待测非标记抗原同时和有限量特异性抗体竞争反应,通过测定放射性核素标记抗原与抗体复合物的放射性活度,经相应的数学函数关系推算待测抗原的含量。其基本原理是竞争抑制反应,由于放射性核素标记抗原和待测非标记抗原对特异性抗体具有相同的结合能力,所以当特异性抗体的量有限时,这种结合就出现相互竞争、彼此抑制的关系。具体反应式如下:
+ Q -Q
(一定量的标记物) (有限量的特异性结合剂) (标记物-结合剂)
+
P (可变量的非标记待测物)
↕
P-Q (非标记待测物-结合剂)
在特异性抗体Q的量一定时,标记抗原P* 和非标记抗原P与Q结合的量取决于二者浓度比。P*-Q结合量将随着P的增加而减少,表明P抑制了P*与Q的结合。测定反应系统中P*-Q或游离P*的放射性活度,通过数据处理即可求出待测非标记抗原P的量。
图6-1 竞争结合原理示意图
从图6-1中可看到简单的量的概念:当反应系统中没有非标记抗原存在时,B/,B/(B+F);随着非标记抗原的增加,B/F或B/(B+F)相应减少。加入的非标记待测物与相应的B/F或B/(B+F)值的函数关系可用曲线表示出来,即为剂量反应曲线,见图6-2,通过剂量反应曲线可推算出待测物的剂量。
图6-2 常用的两种剂量曲线示意图
二、放射免疫分析的基本试剂
(一)标准品
标准品是RIA定量测定的依据,因此,对标准品有如下要求:①化学结构上的要求:标准品应该与待测物具有相同的化学结构。有时结构完全相同的标准品来源困难,可用结构类似且与特异性抗体亲和力亦类似的物质来替代。②化学纯度上的要求:用化学合成法制得的小分子化合物应是化学纯度很高的纯品,有些蛋白质或多肽类物质不易制得足够量的高纯度标准品,要求其所含杂质对竞争性结合反应无干扰。③对含量标定值的要求:标准品应有准确的含量。小分子化合物可通过各自特有的化学或物理特性进行标定,蛋白质或多肽类物质可用精度较高的蛋白定量法进行标定。④运输和保存的要求:放射免疫分析的标准品大多为生物活性物质,易受环境变化的影响而变质,应注意有效期。不同的标准品有不同的最佳保存条件,应在建立方法时通过实验确定。
(2)特异性结合抗体

可应用于RIA的抗体必须具备以下基本条件:①要与待测物有高亲和力(KA)。因KA值越大,该方法的灵敏度和精确度越高,所以KA 值至少要达108 L/mol以上。②要与待测物有尽可能高的特异性。与待测物以外的